許永春 李兆申 龔燕芳 金晶

·論著·

單核細(xì)胞趨化蛋白1在重癥急性胰腺炎相關(guān)肺損傷中的作用

許永春 李兆申 龔燕芳 金晶

目的探討單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)在急性壞死性胰腺炎(ANP)早期并發(fā)急性肺損傷(ALI)發(fā)病機(jī)制中的作用。方法按數(shù)字表法將40只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和ANP 3、6、12 h組，每組10只。采用15%左旋鹽酸精氨酸2.0 mg/g體重腹腔注射方法制作大鼠ANP模型，觀察胰腺及肺組織病理學(xué)改變，檢測(cè)肺濕/干重比，RT-PCR檢測(cè)肺組織MCP-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果腹腔注射左旋鹽酸精氨酸后大鼠胰腺發(fā)生出血、壞死，符合ANP病理改變。ANP組肺組織明顯水腫，3、6、12 h的病理評(píng)分分別為3.75±0.58、5.50±0.63、5.86±0.54；肺濕/干重比為4.85±0.38、4.97±0.47、5.03±0.46；肺組織MCP-1 mRNA表達(dá)量為0.36±0.08、0.56±0.15、0.72±0.21。均較對(duì)照組的0.12±0.05、4.32±0.33、0.21±0.05顯著升高(P<0.05或<0.01)，且MCP-1 mRNA表達(dá)與肺濕/干重比及肺組織損害程度均呈正相關(guān)(r=0.75,r=0.89,P<0.05)。結(jié)論ANP早期肺組織MCP-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，并在ANP并發(fā)的ALI中發(fā)揮重要作用。

胰腺炎，急性壞死性； 單核細(xì)胞趨化蛋白1； 肺組織； 基因表達(dá)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)易并發(fā)急性肺損傷(acute lung injury，ALT)，繼續(xù)發(fā)展甚至導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。 目前認(rèn)為，炎細(xì)胞的激活、遷移、聚集以及激活炎細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子，如單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等參與了此過程[1]。本研究檢測(cè)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠肺組織MCP-1的表達(dá)，探討其在ANP早期肺損傷中所起的作用。

材料與方法

一、材料

健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，上海第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；左旋鹽酸精氨酸(L-arginine)，分析純級(jí) (上海華美生物工程公司提供)，滅菌生理鹽水配置成15%溶液(pH7.0)。寶生物工程(大連)有限公司的一步反應(yīng)法RT-PCR試劑盒；MCP-1及內(nèi)參照β-actin引物根據(jù)GenBank中基因序列自行設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成。

二、方法

1．動(dòng)物模型制作與分組：按數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和ANP 3、6、12 h組，每組10只。采用腹腔注射15%左旋鹽酸精氨酸2.0 mg/g體重兩次、間隔1 h的方法制備ANP模型。對(duì)照組腹腔注射等體積無菌生理鹽水。按各時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，股靜脈采血1 ml，離心取上清置-20℃冰箱保存。

2．血清生化指標(biāo)的檢測(cè)：采用酶法(麥芽6糖)檢測(cè)血淀粉酶，葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖，化學(xué)比色法檢測(cè)血鈣，酶法檢測(cè)肌酐，速率法檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶，在HITACHI 7600型全自動(dòng)生化分析儀(日本)上按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程操作。

3．肺濕/干重比測(cè)定：取肺組織置于60℃干燥箱內(nèi)烤48 h至恒重，計(jì)算肺組織濕/干重比。

4．胰腺及肺組織病理學(xué)評(píng)價(jià)：取胰腺和部分左肺組織常規(guī)甲醛固定，脫水，石蠟包埋，HE染色，由專業(yè)病理醫(yī)師閱片。肺組織切片每張隨機(jī)選10個(gè)高倍鏡視野。肺組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[2]見表1。

5．肺組織MCP-1 mRNA表達(dá)檢測(cè)：按Trizol液說明抽提新鮮肺組織總RNA。MCP-1引物(擴(kuò)增片段290 bp)序列：上游5′-TTCACTGGCAAGATGATCCC-3′，下游5′-TGCTTGAGGTGGTTGTGGAA-3′；β-actin引物(擴(kuò)增片段600 bp)序列：上游5′-AGGGTG-TGATGGTGGGTATG-3′，下游5′-CATAGC-TCTTCTCCAGGGAG-3′。RT-PCR反應(yīng)條件：50℃ 60 min，95℃ 5 min；94℃ 30 s、60℃(MCP-1)或55℃(β-actin)30 s、70℃ 30 s， 35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像掃描儀掃描，以MCP-1 mRNA條帶/β-actin條帶的灰度值比表示MCP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 肺組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、血清生化指標(biāo)的變化

與對(duì)照組相比，ANP各組血淀粉酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血糖及肌酐水平顯著升高(P<0.05或<0.01)，且隨時(shí)間延長呈上升趨勢(shì)，而血鈣水平逐漸降低(P<0.05或<0.01，表2)。

二、胰腺、肺組織病理改變及肺濕/干重比

對(duì)照組胰腺外觀正常；ANP組大鼠胰腺腫脹明顯，質(zhì)地較硬，有大片黃色壞死灶，大網(wǎng)膜、腸系膜上見大量皂化斑，腹腔有中至大量血性腹水。顯微鏡下，對(duì)照組胰腺腺泡和導(dǎo)管未見異常；ANP各組胰腺組織見大片出血、凝固性壞死及脂肪壞死，壞死區(qū)見大量中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，血管破裂出血。

對(duì)照組肺組織正常；ANP 3 h組大鼠肺組織輕度水腫，6 h組水腫明顯、少量血性胸水，12 h組高度水腫，肺表面散在出血點(diǎn)，血性胸水。顯微鏡下，對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整，間質(zhì)無水腫滲出；ANP 3 h組間質(zhì)增寬、充血水腫，見中性粒細(xì)胞浸潤， 6 h組間質(zhì)充血水腫、炎細(xì)胞浸潤，偶見間質(zhì)出血，12 h組間質(zhì)及肺泡腔均有較多中性粒細(xì)胞，部分聚集成團(tuán)，間質(zhì)、肺泡腔出血。ANP各組肺組織病理評(píng)分顯著高于對(duì)照組(P<0.01，表2)。對(duì)照組肺濕/干重比為4.32±0.33，ANP 3、6、12 h的肺濕/干重比分別為4.85±0.38、4.97±0.47、5.03±0.46，較對(duì)照組顯著增加(P<0.05或<0.01)。

表2 各組血清淀粉酶、血糖、血鈣、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶以及肺組織病理評(píng)分的變化

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01

三、肺組織MCP-1 mRNA表達(dá)的變化

對(duì)照組肺組織MCP-1 mRNA有輕度表達(dá)，表達(dá)量為0.21±0.05；ANP組肺組織MCP-1 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05或<0.01)，3、6、12 h的表達(dá)量分別為0.36±0.08、0.56±0.15、0.72±0.21(圖1)。肺組織MCP-1 mRNA的表達(dá)與肺組織濕/干重比以及肺組織病理變化相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.75和0.89(P<0.05)。

圖1對(duì)照組(1)及ANP 3(2)、6(3)、12 h(4)組大鼠肺組織MCP-1 mRNA的表達(dá)

討 論

SAP早期事件發(fā)生在腺泡內(nèi)，一系列炎癥介質(zhì)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)促使炎癥介質(zhì)大量釋放進(jìn)入血循環(huán)，導(dǎo)致重癥患者發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，而肺往往是最易受累的靶器官。研究表明，中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)激活所釋放的細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子、白介素家族成員和血小板活化因子等是SAP并發(fā)ALI的重要始動(dòng)和促進(jìn)因素[1]。

趨化因子是一族低分子量、具有化學(xué)趨化作用的細(xì)胞因子，在生理和一些病理情況下起著促進(jìn)細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)整合蛋白活化、細(xì)胞呼吸爆發(fā)和其他細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，促使多種淋巴因子釋放等作用[3-4]。MCP-1可由體內(nèi)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，受各種炎癥因素刺激后合成增加，與受體結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)Ca2+釋放，蛋白激酶C活化，趨化激活單核巨噬細(xì)胞向炎癥部位聚集參與炎癥反應(yīng)，在敗血癥和其他一些炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。離體胰腺腺泡細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，胰腺腺泡細(xì)胞能持續(xù)合成MCP-1，大劑量雨蛙肽或CCK刺激后可導(dǎo)致MCP-1的合成顯著增加，支持腺泡細(xì)胞自身合成的趨化因子可能是急性胰腺炎(AP)早期的炎癥介質(zhì)之一[4-5]。在AP早期階段， MCP-1即在腺泡細(xì)胞中產(chǎn)生，同時(shí)在血清中MCP-1顯著升高[6]，拮抗MCP-1活性能減輕實(shí)驗(yàn)性AP嚴(yán)重程度[7-8]。在AP的局部并發(fā)癥和遠(yuǎn)處臟器損害的發(fā)病機(jī)制中，MCP-1較其他成員如MIP-1α、MIP-1β等起著更為關(guān)鍵的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在大鼠ANP早期即有ALI的發(fā)生，誘發(fā)ANP 3 h后即可見大鼠肺損傷，12 h更嚴(yán)重，肺濕/干重比顯著增加，肺組織MCP-1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，且肺MCP-1 mRNA表達(dá)與肺組織病理損傷程度及濕/干重比均成正相關(guān)，推測(cè)MCP-1可能是ANP早期并發(fā)ALI重要的前炎癥介質(zhì)。

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2010-12-30)

(本文編輯：呂芳萍)

Roleofmonocytechemotacticprotein-1geneinacutelunginjuryduringacutenecrotizingpancreatitis

XUYong-chun,LIZhao-shen,GONGYan-fang,JINJing.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:zhaoshenli56@gmail.com

ObjectiveTo explore the potential role of monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) gene in the pathogenesis of acute lung injury (ALI) in early acute necrotizing pancreatitis (ANP).MethodsForty SD rats were randomly divided into control group, ANP 3, 6, 12 h group with 10 rats in each group according to a number table. ANP was induced by intraperitoneal injection of 15% L-arginine solution at a dose of 2.0 mg/g body weight. Pathological changes of pancreases and lungs were observed. Lung wet/dry weight ratio was measured. Intrapulmonary expression of MCP-1 mRNA was evaluated by RT-PCR.ResultsAfter intraperitoneal injection of 15% L-arginine solution, the rat′s pancreas presented with bleeding, necrosis comparable with pathological changes of ANP. Pulmonary tissue edema was obvious. At ANP 3, 6, 12 h group, the pathological scores of the lung were 3.75±0.58,5.50±0.63,5.86±0.54, the wet/dry weight ratios were 4.85±0.38,4.97±0.47,5.03±0.46, the MCP-1 mRNA expressions were 0.36±0.08,0.56±0.15,0.72±0.21, which were significantly higher than those in the control group (0.12±0.05,4.32±0.33,0.21±0.05,P<0.05 or <0.01). The MCP-1 mRNA expression in lungs was significantly correlated with the degree of lung damage and wet/dry weight ratio of lungs (r=0.75,r=0.89,P<0.05).ConclusionsMCP-1 mRNA expression was up-regulated in the early phase of ANP in the lungs, and it may play an important role in ALI during ANP.

Pancreatitis,acute necrotizing； Monocyte chemoattractant protein-1； Lung； Gene expression

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.015

全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金資助(08MA064)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院消化科(許永春，現(xiàn)在南昌解放軍第九四醫(yī)院消化內(nèi)科)

李兆申，Email:zhaoshenli56@gmail.com