汪波 張彬 龔元等

摘要：采用垂直平板十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）對我國７種常見水蛭的組織細(xì)胞可溶性蛋白成分進(jìn)行電泳圖譜特性分析。結(jié)果表明，７種水蛭組織細(xì)胞中可溶性蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ圖譜中多數(shù)條帶相同，但也存在差異。其中日本醫(yī)蛭（Ｈｉｒｕｄｏ ｎｉｐｐｏｎｉａ Whitman）蛋白條帶最多，達(dá)２８個，并且吸血蛭類的蛋白條數(shù)要明顯大于非吸血蛭類，而３種不同地理分布的菲牛蛭（Ｈirudinaria ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ Lesson）間表達(dá)蛋白圖譜無明顯差異。該研究為在分子水平分析我國水蛭不同種類、同種不同地理分布及不同食性間的差異積累了新的生物學(xué)數(shù)據(jù)，對其分類和藥材鑒別提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：水蛭；可溶性蛋白；十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

中圖分類號：Ｑ５０３文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）16－3423-03

Analysis of Soluble Proteins in Histiocyte of Seven Leech Species by SDS-PAGE

ＷＡＮＧ Ｂｏ１，ＺＨＡＮＧ Ｂｉｎ２，ＧＯＮＧ Ｙｕａｎ３，ＹＵ Ｘｉａｎｇ４，Ｌ?譈 Ｊｕｎ－ｙｉ５

（１． Ｚｈｕｈａｉ Ｃａｍｐｕｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｚｈｕｈａｉ ５１９０８５， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｇｕａｎｇｘｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ，Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２１， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｊｉｎｇｚｈｏｕ Ｍｉｎkａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４３００， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ； ４． Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｌｉａｏｙａｎｇ １１１０００， Liaoning，Ｃｈｉｎａ； ５． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｕｎ Ｙａｔ－Ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０２７５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｌｅｅｃｈｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｖｅｎ ｌｅｅｃｈ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｈａｒｅｄ ｍｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ； ｗｈｉｌｅ ａ ｆｅｗ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｅｘｉｓｔｅｄ． Ｈｉｒｕｄｏ ｎｉｐｐｏｎｉａ Whitman ｈａｄ ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂａｎｄｓ of ２８． Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｍｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂａｎｄｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ－ｓｕｃｋｉｎｇ ｌｅｅｃｈｅｓ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｎｏｎ－ｂｌｏｏｄｓｕｃｋｉｎｇ ｌｅｅｃｈｅｓ． Ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ Ｈ． ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ Lesson ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｒｅａｓ． Ｉｔ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｅｃｈｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ， ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｏｄ ｈａｂｉｔ ａｔ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｅｖｅｌ， ａｎｄ it ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｄａｔａ ｂａｓｅ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌｅｅｃｈ； ｓｏｌｕｂｌｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ； ＳＤＳ－ＰＡＧＥ

水蛭具有醫(yī)用價值，其藥效在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，它有破血、逐瘀、通經(jīng)的功效，主要用于治療瘤癥、痞塊、血瘀、閉經(jīng)和跌打損傷［１］。水蛭種類繁多，全世界記載命名的有６８０多種，其中我國有記錄的蛭類就達(dá)１００余種［２，３］。我國有醫(yī)用價值的蛭類主要集中在醫(yī)蛭形亞目的醫(yī)蛭科、黃蛭科和山蛭科［１，４］。我國最新藥典（２０１０年版）規(guī)定的藥用水蛭有３種：螞蟥（學(xué)名寬體金線蛭，Whitmania pigra Whitman）、柳葉螞蟥（學(xué)名尖細(xì)金線蛭，Whitmania acranulata Whitman）、水蛭（學(xué)名日本醫(yī)蛭，Hiruao nipponia Whitman），它們分屬于黃蛭科和醫(yī)蛭科［５］。在國內(nèi)水蛭藥材市場，一般通過形態(tài)學(xué)特征加以鑒定，易造成人為的誤判，因此有必要通過理化和分子手段來進(jìn)行水蛭藥材的輔助鑒別。目前，有通過薄層層析和蛋白電泳方法來對歷版藥典收錄的３種水蛭炮制品進(jìn)行鑒別的報道［６－８］，而針對水蛭活體的鑒別研究僅有關(guān)于日本醫(yī)蛭和天目山蛭（Haemadipsa tianmushan Song）４種同工酶蛋白電泳比較研究的報道［９］。試驗采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）技術(shù)對我國７種不同食性和地理分布的水蛭活體組織細(xì)胞可溶性蛋白表達(dá)特征及差異進(jìn)行了分析，為水蛭資源分析、種類鑒定和種類間遺傳多樣性分析提供一定參考。

１材料與方法

１．１試驗材料

寬體金線蛭和光潤金線蛭（Ｗｈｉｔｍａｎｉａ ｌａｅｖｉｓ Ｂａｉｒｄ）產(chǎn)于江蘇省宿遷市，尖細(xì)金線蛭產(chǎn)于山東省魚臺縣，日本醫(yī)蛭產(chǎn)于湖北省公安縣，３種野生菲牛蛭（Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ Ｌｅｓｓｏｎ）分別產(chǎn)于廣東省清遠(yuǎn)市、廣西壯族自治區(qū)欽州市和海南省瓊中縣。

１．２試驗試劑

丙烯酰胺、Ｎ，Ｎ－亞甲基雙丙烯酰胺、ＳＤＳ和β－巰基乙醇等購自Ｓｉｇｍａ公司；過硫酸銨、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）、Ｔｒｉｓ堿、溴酚藍(lán)、冰醋酸和考馬斯亮藍(lán)Ｒ－２５０等購自廣州威佳生物科技有限公司；ＲＩＰＡ裂解液、ＢＣＡ蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。

１．３蛋白樣品制備及純化

①活體水蛭低溫處死后將其腸道翻出，用去離子水洗凈內(nèi)容物，把組織剪切成細(xì)小的碎末，用研缽在液氮條件下將樣品研磨成細(xì)粉末狀［９］；②取適量ＲＩＰＡ裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ），使其最終濃度為１ ｍｍｏｌ／Ｌ；按每２０ ｍｇ組織加入１５０～２５０ μＬ裂解液的比例加入裂解液；③用玻璃勻漿器勻漿至充分裂解后，將組織懸液在４ ℃，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ；④小心避開上層漂浮的脂質(zhì)層，吸取離心后的上清液，在４ ℃，１５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ；⑤吸取離心的上清液，分裝于１．５ ｍＬ的離心管，即為電泳樣品，置于－８０℃下保存；用ＢＣＡ蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。

１．４水蛭組織細(xì)胞可溶性蛋白組分ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳

電源為Ｂio－Ｒad Ｆｉｒｅｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．０７ ＰｏｗｅｒｐａｃＴＭ ＨＣ，電泳槽為Ｍｉｎｉ ＰＲＯＴＥＡＮ ３ Ｃｅｌｌ ６００ＶＤＣ。配制３％濃縮膠和１０％分離膠，每孔加樣２５ μＬ。先以８０ Ｖ恒壓１０ ｍｉｎ電泳至分離膠，再調(diào)為１８０ Ｖ恒壓５０ ｍｉｎ到電泳結(jié)束；將聚丙烯酰胺凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色４ ｈ；傾去染色液，加入脫色液，緩慢搖動脫色，直至獲得藍(lán)色條帶及干凈的背景［１０］。

１．５凝膠圖像分析

分析軟件為上海天能科技有限公司ＧＩＳ凝膠圖像處理系統(tǒng)Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０。

２結(jié)果與分析

７種常見水蛭組織細(xì)胞可溶性蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳圖譜及分析結(jié)果如圖１和圖２所示。圖１顯示７種水蛭的電泳圖譜總體相似度較高，但在蛋白條帶數(shù)目、遷移距離、濃度等方面存在差異，分離出的蛋白組分?jǐn)?shù)目從１９條至２８條不等。獲得的蛋白條帶數(shù)目大小依次為：日本醫(yī)蛭＞菲牛蛭＞光潤金線蛭＞寬體金線蛭＞尖細(xì)金線蛭；其中，日本醫(yī)蛭的蛋白組分?jǐn)?shù)量最多，達(dá)２８條，與其他種類差異明顯；而不同地理分布的３種菲牛蛭（廣東菲牛蛭、廣西菲牛蛭、海南菲牛蛭）間無明顯差異。

根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白及各蛋白條帶的電泳遷移率，通過ＧＩＳ凝膠圖像處理軟件分析，結(jié)果表明在６６．２～９７．４ ku范圍內(nèi)，７種水蛭的蛋白電泳圖譜基本一致；在１４．４～３１．０ ku范圍內(nèi)，廣東菲牛蛭、廣西菲牛蛭、海南菲牛蛭３者之間基本一致，而與其他種類存在明顯差別。相同食性的吸血類水蛭日本醫(yī)蛭和菲牛蛭蛋白組分條帶最多，而非吸血類的光潤金線蛭、寬體金線蛭和尖細(xì)金線蛭蛋白組分條帶較少，統(tǒng)計分析結(jié)果表明吸血蛭類和非吸血蛭類的蛋白表達(dá)存在明顯差異。

３討論

根據(jù)動物組織、細(xì)胞中普遍含有受遺傳基因控制的蛋白組分且具有種的特異性和穩(wěn)定性的特點推斷，不同物種的蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜必定存在差異，以蛋白質(zhì)為指標(biāo)，可以從蛋白水平上進(jìn)行分類［１０］。聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)作為一種蛋白分析技術(shù)，具有操作簡單、快速準(zhǔn)確、成本低且直觀性強(qiáng)的優(yōu)點，適合普及推廣應(yīng)用［１１］。

研究通過聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)比較不同種或同種不同地理分布的水蛭間活體組織細(xì)胞可溶性蛋白組成的差異，結(jié)果表明ＳＤＳ－ＰＡＧＥ能初步反映不同種類、不同食性水蛭組織細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)的表達(dá)差異。蛋白質(zhì)既是由基因決定的，也是基因的產(chǎn)物，作為遺傳特征是可靠的［１０］。因此應(yīng)用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離不同水蛭可溶性蛋白質(zhì)的方法對于其分類和藥材鑒別具有參考價值，尤其對在形態(tài)上不易區(qū)分的種間鑒別具有重要作用。

有學(xué)者認(rèn)為應(yīng)用電泳和薄層色譜等生化和分子生物學(xué)技術(shù)于動物分類學(xué)中，可為其形態(tài)分類增加客觀標(biāo)準(zhǔn)［１２］。研究中分析的３種不同地域分布的菲牛蛭電泳圖譜無明顯差異，而相同食性的日本醫(yī)蛭和３種菲牛蛭則有明顯差異，這一結(jié)果支持了形態(tài)分類確定的３種菲牛蛭為同一個種而菲牛蛭與日本醫(yī)蛭非同種的見解［７］。同時結(jié)果表明吸血蛭類和非吸血蛭類的蛋白組分差異大，而３種非吸血蛭類間差異略有減少，這與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類是相一致的，也說明采用蛋白電泳來探討種間在進(jìn)化上的親緣關(guān)系是一個很有效的手段［１２］。可見，采用電泳技術(shù)分離７種水蛭活體組織細(xì)胞可溶性蛋白組分，不僅有助于了解其蛋白組分及含量，而且在生化分類學(xué)上也有一定的參考價值［９，１２］，在以后的研究中可采用更為精確和客觀的二維蛋白電泳技術(shù)對所獲得的差異蛋白質(zhì)更細(xì)致深入地分析［１３］。

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