汪波 張彬 龔元等
摘要:采用垂直平板十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)對我國7種常見水蛭的組織細胞可溶性蛋白成分進行電泳圖譜特性分析。結果表明,7種水蛭組織細胞中可溶性蛋白的SDS-PAGE圖譜中多數(shù)條帶相同,但也存在差異。其中日本醫(yī)蛭(Hirudo nipponia Whitman)蛋白條帶最多,達28個,并且吸血蛭類的蛋白條數(shù)要明顯大于非吸血蛭類,而3種不同地理分布的菲牛蛭(Hirudinaria manillensis Lesson)間表達蛋白圖譜無明顯差異。該研究為在分子水平分析我國水蛭不同種類、同種不同地理分布及不同食性間的差異積累了新的生物學數(shù)據(jù),對其分類和藥材鑒別提供了參考依據(jù)。
關鍵詞:水蛭;可溶性蛋白;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
中圖分類號:Q503文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2011)16-3423-03
Analysis of Soluble Proteins in Histiocyte of Seven Leech Species by SDS-PAGE
WANG Bo1,ZHANG Bin2,GONG Yuan3,YU Xiang4,L?譈 Jun-yi5
(1. Zhuhai Campus, Beijing Normal University, Zhuhai 519085, Guangdong, China; 2. Guangxi Institute of Fisheries,Nanning 530021, China; 3. Jingzhou Minkang Biotechnology Co. Ltd., Jingzhou 434300, Hubei, China; 4. Freshwater Fisheries Research Institute of Liaoning Province, Liaoyang 111000, Liaoning,China; 5. School of Life Sciences, Sun Yat-Sen University, Guangzhou510275, China)
Abstract: The histiocyte soluble proteins of seven leeches in China were analyzed through SDS-PAGE. The results showed that the seven leech species shared most of the soluble proteins components of histiocyte; while a few differences existed. Hirudo nipponia Whitman had the largest number of protein bands of 28. There were more protein bands of blood-sucking leeches than that of non-bloodsucking leeches. No significant difference was detected among the histiocyte soluble proteins components of H. manillensis Lesson from three different areas. It was proved that SDS-PAGE could be used for classification and identification of leeches of different varieties, geographic distribution and food habit at the molecular level, and it accumulated data base of biologicalproperty.
Key words: leech; soluble-protein; SDS-PAGE
水蛭具有醫(yī)用價值,其藥效在《神農本草經》中就有記載,它有破血、逐瘀、通經的功效,主要用于治療瘤癥、痞塊、血瘀、閉經和跌打損傷[1]。水蛭種類繁多,全世界記載命名的有680多種,其中我國有記錄的蛭類就達100余種[2,3]。我國有醫(yī)用價值的蛭類主要集中在醫(yī)蛭形亞目的醫(yī)蛭科、黃蛭科和山蛭科[1,4]。我國最新藥典(2010年版)規(guī)定的藥用水蛭有3種:螞蟥(學名寬體金線蛭,Whitmania pigra Whitman)、柳葉螞蟥(學名尖細金線蛭,Whitmania acranulata Whitman)、水蛭(學名日本醫(yī)蛭,Hiruao nipponia Whitman),它們分屬于黃蛭科和醫(yī)蛭科[5]。在國內水蛭藥材市場,一般通過形態(tài)學特征加以鑒定,易造成人為的誤判,因此有必要通過理化和分子手段來進行水蛭藥材的輔助鑒別。目前,有通過薄層層析和蛋白電泳方法來對歷版藥典收錄的3種水蛭炮制品進行鑒別的報道[6-8],而針對水蛭活體的鑒別研究僅有關于日本醫(yī)蛭和天目山蛭(Haemadipsa tianmushan Song)4種同工酶蛋白電泳比較研究的報道[9]。試驗采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術對我國7種不同食性和地理分布的水蛭活體組織細胞可溶性蛋白表達特征及差異進行了分析,為水蛭資源分析、種類鑒定和種類間遺傳多樣性分析提供一定參考。
1材料與方法
1.1試驗材料
寬體金線蛭和光潤金線蛭(Whitmania laevis Baird)產于江蘇省宿遷市,尖細金線蛭產于山東省魚臺縣,日本醫(yī)蛭產于湖北省公安縣,3種野生菲牛蛭(Hirudinaria manillensis Lesson)分別產于廣東省清遠市、廣西壯族自治區(qū)欽州市和海南省瓊中縣。
1.2試驗試劑
丙烯酰胺、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、SDS和β-巰基乙醇等購自Sigma公司;過硫酸銨、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、Tris堿、溴酚藍、冰醋酸和考馬斯亮藍R-250等購自廣州威佳生物科技有限公司;RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。
1.3蛋白樣品制備及純化
①活體水蛭低溫處死后將其腸道翻出,用去離子水洗凈內容物,把組織剪切成細小的碎末,用研缽在液氮條件下將樣品研磨成細粉末狀[9];②取適量RIPA裂解液,在使用前數(shù)分鐘內加入苯甲基磺酰氟(PMSF),使其最終濃度為1 mmol/L;按每20 mg組織加入150~250 μL裂解液的比例加入裂解液;③用玻璃勻漿器勻漿至充分裂解后,將組織懸液在4 ℃,8 000 r/min離心10 min;④小心避開上層漂浮的脂質層,吸取離心后的上清液,在4 ℃,15 000 r/min離心10 min;⑤吸取離心的上清液,分裝于1.5 mL的離心管,即為電泳樣品,置于-80℃下保存;用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。
1.4水蛭組織細胞可溶性蛋白組分SDS-PAGE電泳
電源為Bio-Rad Fireware Version 1.07 PowerpacTM HC,電泳槽為Mini PROTEAN 3 Cell 600VDC。配制3%濃縮膠和10%分離膠,每孔加樣25 μL。先以80 V恒壓10 min電泳至分離膠,再調為180 V恒壓50 min到電泳結束;將聚丙烯酰胺凝膠用考馬斯亮藍染色液染色4 h;傾去染色液,加入脫色液,緩慢搖動脫色,直至獲得藍色條帶及干凈的背景[10]。
1.5凝膠圖像分析
分析軟件為上海天能科技有限公司GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)Version 4.0。
2結果與分析
7種常見水蛭組織細胞可溶性蛋白SDS-PAGE電泳圖譜及分析結果如圖1和圖2所示。圖1顯示7種水蛭的電泳圖譜總體相似度較高,但在蛋白條帶數(shù)目、遷移距離、濃度等方面存在差異,分離出的蛋白組分數(shù)目從19條至28條不等。獲得的蛋白條帶數(shù)目大小依次為:日本醫(yī)蛭>菲牛蛭>光潤金線蛭>寬體金線蛭>尖細金線蛭;其中,日本醫(yī)蛭的蛋白組分數(shù)量最多,達28條,與其他種類差異明顯;而不同地理分布的3種菲牛蛭(廣東菲牛蛭、廣西菲牛蛭、海南菲牛蛭)間無明顯差異。
根據(jù)分子量標準蛋白及各蛋白條帶的電泳遷移率,通過GIS凝膠圖像處理軟件分析,結果表明在66.2~97.4 ku范圍內,7種水蛭的蛋白電泳圖譜基本一致;在14.4~31.0 ku范圍內,廣東菲牛蛭、廣西菲牛蛭、海南菲牛蛭3者之間基本一致,而與其他種類存在明顯差別。相同食性的吸血類水蛭日本醫(yī)蛭和菲牛蛭蛋白組分條帶最多,而非吸血類的光潤金線蛭、寬體金線蛭和尖細金線蛭蛋白組分條帶較少,統(tǒng)計分析結果表明吸血蛭類和非吸血蛭類的蛋白表達存在明顯差異。
3討論
根據(jù)動物組織、細胞中普遍含有受遺傳基因控制的蛋白組分且具有種的特異性和穩(wěn)定性的特點推斷,不同物種的蛋白質電泳指紋圖譜必定存在差異,以蛋白質為指標,可以從蛋白水平上進行分類[10]。聚丙烯酰胺凝膠電泳技術作為一種蛋白分析技術,具有操作簡單、快速準確、成本低且直觀性強的優(yōu)點,適合普及推廣應用[11]。
研究通過聚丙烯酰胺凝膠電泳技術比較不同種或同種不同地理分布的水蛭間活體組織細胞可溶性蛋白組成的差異,結果表明SDS-PAGE能初步反映不同種類、不同食性水蛭組織細胞可溶性蛋白質的表達差異。蛋白質既是由基因決定的,也是基因的產物,作為遺傳特征是可靠的[10]。因此應用SDS-PAGE分離不同水蛭可溶性蛋白質的方法對于其分類和藥材鑒別具有參考價值,尤其對在形態(tài)上不易區(qū)分的種間鑒別具有重要作用。
有學者認為應用電泳和薄層色譜等生化和分子生物學技術于動物分類學中,可為其形態(tài)分類增加客觀標準[12]。研究中分析的3種不同地域分布的菲牛蛭電泳圖譜無明顯差異,而相同食性的日本醫(yī)蛭和3種菲牛蛭則有明顯差異,這一結果支持了形態(tài)分類確定的3種菲牛蛭為同一個種而菲牛蛭與日本醫(yī)蛭非同種的見解[7]。同時結果表明吸血蛭類和非吸血蛭類的蛋白組分差異大,而3種非吸血蛭類間差異略有減少,這與傳統(tǒng)的形態(tài)學分類是相一致的,也說明采用蛋白電泳來探討種間在進化上的親緣關系是一個很有效的手段[12]。可見,采用電泳技術分離7種水蛭活體組織細胞可溶性蛋白組分,不僅有助于了解其蛋白組分及含量,而且在生化分類學上也有一定的參考價值[9,12],在以后的研究中可采用更為精確和客觀的二維蛋白電泳技術對所獲得的差異蛋白質更細致深入地分析[13]。
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