陳海剛，朱 蘭，崔全才，郞景和，李 玢

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1婦產(chǎn)科 2病理科，北京100730

子宮肌瘤是女性生殖系統(tǒng)中最常見的一種良性腫瘤，多見于育齡女性，40～50歲婦女的發(fā)病率高達(dá)51%～60%，且呈逐年上升趨勢(shì)，53%的婦女子宮切除的指征是子宮肌瘤［1］。但目前該病的病因和發(fā)病機(jī)制尚未清楚。子宮肌瘤動(dòng)物模型的建立也處于研究階段。本研究基于肌瘤對(duì)雌激素 (estrogen，E2)的高度敏感性以及E2在其發(fā)病機(jī)制中的重要地位［2-6］，利用處于繁殖期的雌性大鼠，外源性給予E2，探討不同劑量及給藥周期對(duì)大鼠子宮肌瘤形成的影響，并與人子宮肌瘤進(jìn)行病理組織學(xué)比較，探討動(dòng)物模型的最佳建立方法。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級(jí) Sprague-Dawley大鼠60只(北京協(xié)和醫(yī)院動(dòng)物中心)，雌性，未經(jīng)生育交配，體重 (200±20)g。飼養(yǎng)條件:室溫 (23±2)℃，相對(duì)濕度50%～70%，光照12 h，黑暗12 h，每籠5只。以清潔級(jí)維持鼠料和凈化水飼養(yǎng)，自由飲水、自由攝食。所有動(dòng)物抵達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，馴化至少1周后用于實(shí)驗(yàn)。

E2誘導(dǎo)大鼠子宮肌瘤模型建立參照Fujii等［7］的方法建立E2誘導(dǎo)的大鼠子宮肌瘤模型。將60只大鼠隨機(jī)分為3組，分別為200 μg模型組 (n=20)，每只大鼠肌肉注射E2200 μg，每周2次;300 μg模型組(n=20)，每只肌肉注射E2300 μg，每周2次;正常對(duì)照組 (n=20)，肌肉注射生理鹽水0.1 ml，每周2次。于實(shí)驗(yàn)8周和10周時(shí)分別處死動(dòng)物每組各10只，將子宮完整剪下，觀察子宮和肌瘤形態(tài)，計(jì)算肌瘤形成率和子宮臟器系數(shù) (子宮重量/體重×100%)，并將子宮固定于10%甲醛固定液中。

血清雌、孕激素水平分別于實(shí)驗(yàn)8周和10周于眶動(dòng)脈取血1 ml，3000 r/min(r=10 cm)離心10 min分離血清，測(cè)定血清E2和孕激素 (progesterone，P)含量。

子宮病理組織學(xué)觀察子宮組織經(jīng)10%甲醛固定液固定48 h后以石蠟包埋，4 μm切片，HE染色。顯微鏡下觀察染色切片，并與人子宮肌瘤病理切片進(jìn)行比較。

子宮雌、孕激素受體表達(dá)免疫組織化學(xué)法測(cè)定子宮雌激素受體 (estrogen receptor，ER)及孕激素受體 (progesterone receptor，PR)的表達(dá)?？笶R多克隆抗體及抗PR多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，按試劑盒說明染色，組織切片中出現(xiàn)棕黃色顆粒著色即為ER和PR表達(dá)陽性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用F檢驗(yàn)，定性資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

不同給藥劑量和周期對(duì)大鼠子宮肌瘤形成的影響對(duì)照組大鼠子宮質(zhì)地均勻，未見結(jié)節(jié)或囊腫。兩模型組大鼠于8周和10周時(shí)可見子宮形態(tài)改變、肌層增生，個(gè)別大鼠分角子宮可見肌壁間肌瘤、漿膜下肌瘤。200 μg組平均肌瘤形成率為30%，300 μg組平均肌瘤形成率為20%，均較對(duì)照組顯著增加 (P＜0.05)。不同劑量模型組8周及10周平均肌瘤形成率為25%。兩模型組動(dòng)物死亡率均為15%，高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同劑量模型組10周的平均動(dòng)物死亡率為30%，顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)，而3組的8周動(dòng)物死亡率皆為0。

E2對(duì)大鼠子宮重量和臟器系數(shù)的影響200 μg組大鼠的子宮重量和臟器系數(shù)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，300 μg組大鼠8周的子宮重量和臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但10周的子宮重量和臟器系數(shù)顯著增加 (P＜0.01)(表1)。

表1 雌激素對(duì)大鼠子宮重量和臟器系數(shù)的影響 (n=20，±s)Table 1 The changes in uterine weight and organ coefficient after estrogen injection(n=20，±s)

表1 雌激素對(duì)大鼠子宮重量和臟器系數(shù)的影響 (n=20，±s)Table 1 The changes in uterine weight and organ coefficient after estrogen injection(n=20，±s)

與對(duì)照組比較，aP＜0.01aP＜0.01 compared with control group

Group n 周期Duration(w)分組體重Weight(g)子宮重量Uterine weight(g)臟器系數(shù)Organ coefficient(%)對(duì)照組Control group 10 8 277.3±17.0 0.83±0.25 0.30±0.10 10 10 293.8±23.4 0.77±0.23 0.26±0.09 200 μg組 200 μg group 10 8 263.7±24.5 1.03±0.42 0.41±0.22 7 10 262.7±11.6 3.15±4.58 1.16±1.63 300 μg組 300 μg group 10 8 251.3±14.5 3.79±5.84 1.53±2.43 7 10 256.7±22.2 1.54±0.67a 0.59±0.21a

E2注射對(duì)大鼠血清E2、P水平的影響與對(duì)照組相比，兩模型組的血清E2水平均顯著升高 (P＜0.01)。200 μg組的血清P水平與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，而300 μg組的血清P水平顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05)(表2)。

大鼠與人子宮肌瘤病理組織學(xué)特征對(duì)照組大鼠子宮肌壁厚度均勻，色澤淡紅，未見結(jié)節(jié)或囊腫形成;模型組大鼠于8周和10周解剖時(shí)見明顯增生，甚至出現(xiàn)腫塊 (圖1)。鏡下觀察似人的肌瘤表現(xiàn) (圖2)。

E2對(duì)大鼠子宮ER、PR表達(dá)的影響ER、PR

蛋白在子宮內(nèi)膜組織、內(nèi)膜下組織和肌層組織的胞漿內(nèi)均可表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示，所有標(biāo)本均不同程度地表達(dá)ER、PR，陽性細(xì)胞表達(dá)部位均以細(xì)胞核著色為主。對(duì)照組子宮組織中，部分細(xì)胞胞漿內(nèi)可見淺黃色ER、PR蛋白顆粒著色;兩模型組子宮組織中大量細(xì)胞胞漿內(nèi)均可見黃褐色的ER、PR蛋白顆粒著色，陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，且肌瘤組織中的陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于鄰近正常平滑肌組織 (圖3)。

討 論

子宮肌瘤的發(fā)病原因復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為子宮肌瘤為性激素依賴性腫瘤，長(zhǎng)期高水平卵巢激素的刺激是導(dǎo)致子宮肌瘤發(fā)生的重要致病因素［8］。本研究通過對(duì)雌性大鼠給予不同劑量和時(shí)間的E2，探討通過E2給藥建立子宮肌瘤動(dòng)物模型的可行性。

本研究結(jié)果顯示，模型組大部分大鼠的子宮均出現(xiàn)了較明顯的平滑肌瘤樣改變，并且在病理組織學(xué)上與人子宮肌瘤相似，而對(duì)照組大鼠的子宮在肉眼與鏡下觀察均無明顯變化，提示模型建立成功。

本研究發(fā)現(xiàn)，外源性給予E2后，血清E2水平升高，子宮重量和臟器系數(shù)增加，部分大鼠形成子宮肌瘤，ER表達(dá)明顯增強(qiáng)。此結(jié)果表明，子宮肌瘤具有明顯的E2依賴性，E2可能是誘導(dǎo)子宮肌瘤形成的直接因素。

研究中分組給予大鼠 E2200 μg/只和 300 μg/只，200 μg組平均肌瘤形成率為30%，300 μg組平均肌瘤形成率為20%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)給藥周期分析可見，給藥8周和10周的肌瘤形成率均為25%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果提示延長(zhǎng)E2的作用時(shí)間或許并不能顯著提高肌瘤形成率。在200～300 μg/只的給藥劑量下，給藥8周即可達(dá)到較好的肌瘤形成率。

在給藥劑量為 200 μg/只和 300 μg/只時(shí)，10 周動(dòng)物死亡率無差異，但高劑量組大鼠的死亡時(shí)間均早于低劑量組，提示E2誘導(dǎo)劑量可能與動(dòng)物死亡率有關(guān)。這也可能是導(dǎo)致300 μg模型組肌瘤形成率低于200 μg模型組的原因。同時(shí)，10周時(shí)的動(dòng)物死亡率顯著高于8周，表明動(dòng)物死亡率與E2給藥周期可能存在正相關(guān)。綜合評(píng)價(jià)，給藥劑量為200 μg/只時(shí)可獲得較好的存活率和肌瘤形成率。

由于肌瘤形成之前可能出現(xiàn)肌細(xì)胞肥大增生、膠原纖維增生活躍、子宮微小肌瘤等［9］，僅通過病理組織學(xué)觀察子宮肌瘤形成情況尚不能完全反映E2對(duì)子宮平滑肌細(xì)胞增生的促進(jìn)作用，用子宮重量和臟器系數(shù)能夠更加準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)E2的作用。數(shù)據(jù)分析可見，隨著給藥劑量增加、時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠子宮平滑肌細(xì)胞及纖維組織增生程度增加，子宮重量和臟器系數(shù)的增加均存在E2依賴性。

在E2連續(xù)給藥后，大鼠體內(nèi)E2水平持續(xù)升高，并且與給藥時(shí)間和給藥劑量都存在相關(guān)性。與之相反，P水平則呈下降趨勢(shì)，考慮可能與體內(nèi)性腺軸的反饋抑制有關(guān)。

E2是子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展的主要因素，而目前關(guān)于P對(duì)子宮肌瘤的作用尚存在爭(zhēng)議。部分觀點(diǎn)認(rèn)為，P能抑制子宮肌瘤生長(zhǎng)，但近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)P在肌瘤的發(fā)病中也起著重要作用［10］。大量臨床實(shí)踐證實(shí)，P能夠抑制GnRH-a產(chǎn)生的E2不足和子宮肌瘤縮小的作用。應(yīng)用P拮抗劑米非司酮可使肌瘤體積明顯縮小［11］，進(jìn)一步說明了P在子宮肌瘤發(fā)病中具有重要作用。

表2 大鼠血清雌、孕激素水平 (n=20，±s)Table 2 The serum estrogen(E2)and progesterone(P)levels in the rats(n=20，±s)

表2 大鼠血清雌、孕激素水平 (n=20，±s)Table 2 The serum estrogen(E2)and progesterone(P)levels in the rats(n=20，±s)

與對(duì)照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01aP ＜0.05，bP ＜0.01 compared with control group

Group n 周期Duration(w)分組E2P(pg/ml)(ng/ml)對(duì)照組Control group 10 8 110.94± 60.66 24.17±15.29 10 10 107.35± 48.11 19.56± 8.23 200 μg組 200 μg group 10 8 1068.87 ±201.98b 16.08 ±17.40 7 10 1204.33±159.06b 14.08± 6.53 300 μg組 300 μg group 10 8 1320.36 ±557.91b 10.07 ± 4.78a 7 10 1630.34±440.91b 11.25± 5.03a

本研究結(jié)果顯示，給予外源性E2后，模型組動(dòng)物在血清E2水平明顯升高的同時(shí)，P水平降低;子宮增生、變形，并伴有肌瘤形成，模型組大鼠子宮組織中ER和PR的表達(dá)均明顯強(qiáng)于對(duì)照組。說明外源性E2可抑制血清P水平，但可增強(qiáng)子宮PR的表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［12］。曾有研究報(bào)道［7］，在模型開始建立時(shí)同時(shí)使用高劑量P和E2處理動(dòng)物可抑制肌瘤形成。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，血清中P的含量并非導(dǎo)致子宮肌瘤產(chǎn)生的必要因素，而局部組織中高濃度的ER、PR表達(dá)與子宮肌瘤的發(fā)生密切相關(guān)。

綜上，使用性成熟的雌性大鼠，給予E2200 μg/只，2次/周，連續(xù)8周后可成功建立子宮肌瘤動(dòng)物模型，其病理組織學(xué)特征與人子宮肌瘤相似，可用于子宮肌瘤發(fā)病機(jī)制研究和治療藥物篩選。

［1］Schwartz SM，Marshall LM，Baird DD.Epidemiologic contributions to understanding the etiology of uterine leiomyomata［J］.Environ Health Perspect，2000，108 Suppl 5:821-827.

［2］Porter KB，Tsibris JC，Nicosia SV，et al.Estrogen-induced guinea pig model for uterine leiomyomas:do the ovaries protect［J］?Biol Reprod，1995，52(4):824-832.

［3］Walker CL，Hunter D，Everitt JI.Uterine leiomyoma in the Eker rat:a unique model for important diseases of women［J］.Genes Chromosomes Cancer，2003，38(4):349-356.

［4］Mizutani T，Sugihara A，Nakamuro K，et al.Suppression of cell proliferation and induction of apoptosis in uterine leiomyoma by gonadotropin-releasing hormone agonist(leuprolide acetate)［J］.J Clin Endocrinol Metab，1998，83(4):1253-1255.

［5］Brandon DD，Erickson TE，Keenan EJ，et al.Estrogen receptor gene expression in human uterine leiomyomata［J］.J Clin Endocrinol Metab，1995，80(6):1876-1881.

［6］Chegini N，Verala J，Luo X，et al.Gene expression profile of leiomyoma and myometrium and the effect of gonadotropin releasing hormone analogue therapy［J］.J Soc Gynecol Investig，2003，10(3):161-171.

［7］Fujii S，Nakashima N，Okamura H，et al.Progesterone-induced smooth muscle-like cells in the subperitoneal nodules produced by estrogen.Experimental approach to leiomyomatosis peritonealis disseminata ［J］.Am J Obstet Gynecol，1981，139(2):164-172.

［8］曹斌融.子宮體腫瘤 ［M］//張惜陰.實(shí)用婦科學(xué).2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003:651-657.

［9］Zbucka M，Miltyk W，Bielawski T，et al.Mechanism of collagen biosynthesis up-regulation in cultured leiomyoma cells［J］.Folia Histochem Cytobiol，2007，45 Suppl 1:S181-S185.

［10］Maruo T，Ohara N，Wang J，et al.Sex steroidal regulation of uterine leiomyoma growth and apoptosis［J］.Hum Reprod Update，2004，10(3):207-220.

［11］Engman M，Granberg S，Williams AR，et al.Mifepristone for treatment of uterine leiomyoma.a prospective randomized placebo controlled trial［J］.Hum Reprod，2009，24(8):1870-1879.

［12］Englund K，Blanck A，Gustavsson I，et al.Sex steroid receptors in human myometrium and fibroids:changes during the menstrual cycle and gonadotropin-releasing hormone treatment［J］.J Clin Endocrinol Metab，1998，83(11):4092-4096.

圖1 大鼠子宮病理組織學(xué)變化Fig 1 The pathohistological changes of the uteri of the rats

圖2 大鼠與人子宮病理組織學(xué)比較 (HE)Fig 2 The histological comparison between human and rat uteri(HE)

圖3 免疫組織化學(xué)染色測(cè)定子宮ER和PR表達(dá) (×20)Fig 3 Investigations of the ER and PR in rats'uteri by immunohistochemical staining(×20)