文 進，李漢忠，紀志剛，嚴維剛，石冰冰

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科，北京100730

受體酪氨酸激酶 (receptor tyrosine kinases，RTKs)在浸潤性膀胱尿路上皮癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，是啟動腫瘤細胞內(nèi)造成癌進展、轉(zhuǎn)移和治療抵抗性等生物學(xué)特性的信號事件級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵。本研究采用實時定量PCR芯片和蛋白芯片，檢測膀胱癌RTKs mRNA及蛋白表達，以發(fā)現(xiàn)有前景的生物標(biāo)志物及可能的藥物靶點，為將靶向藥物治療膀胱癌應(yīng)用于臨床提供實驗依據(jù)。

材料和方法

RTKs實時定量PCR芯片檢測

標(biāo)本來源:實驗組膀胱腫瘤組織取自手術(shù)切除的標(biāo)本，直徑為2 cm，術(shù)后經(jīng)病理檢查證實為高級別浸潤性膀胱尿路上皮癌，侵犯深肌層，臨床分期為T2bN0M0。對照組為經(jīng)病理證實的、腫瘤旁2 cm以外正常膀胱組織。

總RNA抽提及鑒定:采用Trizol一步法抽提實驗組總膀胱癌組織及對照組膀胱組織RNA，抽提的總RNA用分光光度法檢測其量和純度，測定260 nm波長的吸光度以定量，測定260 nm和280 nm波長吸光度的比值以確定純度。

實時定量PCR:聚合酶激活/變性，95℃ 10 min;擴增40個循環(huán)，95℃ 15 s;60℃ 1 min，收集熒光。

陽性結(jié)果判斷:Log2(FC)＞2或＜-2為差異表達基因。

RTKs蛋白芯片檢測

選取RayBio人細胞因子抗體芯片試劑盒，X線膠片曝光后，將膠片上的圖象用掃描儀掃描并轉(zhuǎn)換為灰度TIFF格式的圖片文件保存。運行ScanAlyze軟件，將灰度TIFF格式圖片的點陣轉(zhuǎn)化為數(shù)字型數(shù)據(jù)，將此原始數(shù)據(jù)儲存為Microsoft Excel文件。

結(jié) 果

篩選出的RTKs差異表達基因TGFA、STAB1、SERPINE1、ANGPT2、 SPINK5、 ANGPTL1、 PROK1、MDK、CXCL9、GRN、RUNX1、VEGFA、TGFB1在膀胱癌組織中的表達顯著上調(diào)，EDIL3、PTN、CCL2、PDGFD、FGF13、 KITLG、 FGF2、 SERPINF1、 TNF的表達顯著下調(diào) (圖1)。

篩選出的RTKs差異蛋白ALK、Btk、EphB2、ErbB4、PDGFR-α、ROS、Tie-2、Tyk2、VEGFR3 蛋白在膀胱癌組織中高表達，F(xiàn)RK、Fyn、IGF-IR、Insulin R、Itk、JAK1、JAK3、LCK蛋白低表達 (圖2)。

討 論

膀胱癌的發(fā)病率占我國泌尿系統(tǒng)腫瘤的首位，是一種嚴重威脅患者健康的疾病。膀胱癌95%以上為尿路上皮癌，大約20%有基層浸潤 (T2～T4)，5%診斷時已有遠處轉(zhuǎn)移［1］。浸潤性膀胱尿路上皮癌早期癥狀較少，進展快，易復(fù)發(fā);晚期經(jīng)各種治療，預(yù)后仍較差。近年來出現(xiàn)了以吉西他濱聯(lián)合順鉑為基礎(chǔ)的標(biāo)準一線化療方案，使得治療晚期浸潤性膀胱尿路上皮癌的有效率大大提高，但并不能使其預(yù)后發(fā)生質(zhì)的改變。導(dǎo)致這一結(jié)果的主要原因是由于浸潤性膀胱尿路上皮癌對化療藥物的耐藥及化療藥物本身的不良反應(yīng)，因此發(fā)展以膀胱癌分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的新治療方法顯得十分必要和緊迫［2］。

圖1 膀胱癌受體酪氨酸激酶實時定量PCR擴增圖Fig 1 Real-time quantitative PCR array of receptor tyrosine kinases in bladder cancer tissue

圖2 膀胱癌受體酪氨酸激酶蛋白芯片的灰度TIFF格式圖片點陣Fig 2 Cytokine antibody array of receptor tyrosine kinases in bladder cancer tissue

眾所周知，浸潤性膀胱尿路上皮癌以空間上的多中心與時間上的反復(fù)發(fā)作為特點，其發(fā)病機制仍不完全明確。分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展使得人們能夠不斷從基因和蛋白水平尋找膀胱癌發(fā)病機制及腫瘤標(biāo)志物。在過去的20年里，人們對于腫瘤分子發(fā)病機制的認識顯著提高，發(fā)現(xiàn)了一系列調(diào)節(jié)浸潤性膀胱尿路上皮癌發(fā)生、發(fā)展的蛋白激酶，從而促進了以抑制腫瘤蛋白激酶為目標(biāo)的分子靶向治療的發(fā)展。人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)浸潤性膀胱尿路上皮癌細胞外受體、受體信號途徑水平的存在潛在的干預(yù)點［3-4］。其中RTKs在膀胱尿路上皮癌發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。RTKs被激活后發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞周期進展、有絲分裂信號和許多其他對癌癥進展很關(guān)鍵的事件發(fā)生，被認為是理想的抗腫瘤藥物治療靶點。

酪氨酸激酶調(diào)節(jié)是幾乎所有至今發(fā)現(xiàn)的以RTKs為基礎(chǔ)的廣泛的信號傳導(dǎo)途徑。RTKs是膜結(jié)合的Ⅰ型糖蛋白，其結(jié)構(gòu)的共同特點是整個分子可分成3個結(jié)構(gòu)區(qū)，即胞外的配體結(jié)合區(qū)、細胞內(nèi)部具酪氨酸激酶活性的功能區(qū)和連接這2個區(qū)域的由疏水氨基酸組成的跨膜區(qū)。配體結(jié)合RTKs胞外區(qū)域后使其構(gòu)象發(fā)生變化，引起受體在胞膜上遷移、聚集，并形成寡聚化的受體配體復(fù)合物，激活胞漿的酪氨酸激酶而活化，導(dǎo)致自身磷酸化及下游大量胞內(nèi)底物蛋白質(zhì)分子的酪氨酸磷酸化，啟動不同信號途徑將信號逐級傳遞。以RTKs為基礎(chǔ)的信號傳導(dǎo)途徑包括Ras-Raf有絲分裂原激活的蛋白激酶途徑、磷酯酰肌醇-3激酶/AKt途徑和核因子κB途徑，因此被認為是啟動腫瘤細胞內(nèi)造成癌進展、轉(zhuǎn)移和治療抵抗性等生物學(xué)特性的信號事件級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵［5］。

本研究采用實時定量PCR芯片和蛋白芯片，檢測出高級別浸潤性膀胱癌組織中TGFA、STAB1、SERPINE1、ANGPT2、 SPINK5、 ANGPTL1、 PROK1、MDK、CXCL9、GRN、RUNX1、VEGFA、TGFB1基因顯著上調(diào)，而EDIL3、PTN、CCL2、PDGFD、FGF13、KITLG、FGF2、SERPINF1、TNF基因顯著下調(diào);ALK、Btk、EphB2、ErbB4、PDGFR-α、ROS、Tie-2、Tyk2、VEGFR3蛋白在膀胱癌組織中高表達，F(xiàn)RK、Fyn、IGF-IR、Insulin R、Itk、JAK1、JAK3、LCK蛋白低表達。膀胱癌血管內(nèi)皮生長因子/血小板衍生生長因子mRNA及蛋白表達顯著增高。進一步證實RTKs家族中的眾多成員直接參與了膀胱癌的發(fā)生和進展。而其中的血管內(nèi)皮生長因子正是新型靶向藥物甲苯磺酸索拉非尼、蘋果酸舒尼替尼的作用位點，由此推測靶向RTKs藥物可能在治療膀胱癌方面發(fā)揮積極作用。進一步運用蛋白芯片及動物實驗?zāi)Ｐ万炞C相關(guān)結(jié)果，將有助于未來將靶向藥物應(yīng)用于臨床治療膀胱癌。

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