姚旺祥，馬 安，朱六龍，陸 凱，朱 敏，彭兆祥，邊振宇，何其芳

1杭州市第一人民醫(yī)院骨科，杭州310006

2浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲(chóng)病研究所診斷室，杭州310003

3上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院骨科，上海200011

全世界每年因創(chuàng)傷、腫瘤、感染等原因造成的骨缺損患者超過(guò)80萬(wàn)例，其中大段骨缺損是目前骨科臨床治療的難點(diǎn)之一，自體骨移植是解決該問(wèn)題最理想的方法，但其供給量非常有限，且供區(qū)存在發(fā)生感染和慢性疼痛等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，特別是對(duì)于大段骨缺損更顯得力不從心。同種異體骨和異種骨也可用于治療大段、大塊骨缺損，但存在傳播傳染性疾病和排斥反應(yīng)的缺點(diǎn)，因此尋找安全、有效的生物骨替代材料一直是研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，隨著組織工程學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，通過(guò)體外組織工程技術(shù)制備骨替代材料修復(fù)臨床常見(jiàn)的陳舊性骨缺損、骨不連受到越來(lái)越多的關(guān)注。而組織工程用種子細(xì)胞的獲取及其與材料的復(fù)合仍是研究的主要內(nèi)容。如何獲得足夠、即刻使用的種子細(xì)胞及如何使用微創(chuàng)方法修復(fù)臨床常見(jiàn)的骨缺損都是急需解決的問(wèn)題［1］。本研究通過(guò)濃縮自體骨髓獲取骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，采用臨床廣泛使用的纖維蛋白膠 (fibrin glue，F(xiàn)G)作為支架，通過(guò)注射這一微創(chuàng)方法修復(fù)陳舊性兔橈骨缺損，并初步探討其促進(jìn)成骨的機(jī)制。

材料和方法

兔橈骨陳舊性骨缺損模型的構(gòu)建與實(shí)驗(yàn)分組6月齡新西蘭大白兔36只，雌雄不限，體重 (2100±300)g，購(gòu)自上海市第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。采用速眠新、氯胺酮和阿托品復(fù)合肌注麻醉。左前肢中段內(nèi)側(cè)切口，長(zhǎng)約3 cm。顯露橈骨，分開(kāi)尺、橈骨間膜，在距肘關(guān)節(jié)2.5 cm處完整截除帶有骨膜的橈骨1.5 cm。兩骨斷端髓腔用骨蠟封閉，分層縫合切口。術(shù)后無(wú)外固定，分籠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，術(shù)后每天肌注青霉素40萬(wàn)U 1次，連續(xù)3 d。術(shù)后1個(gè)月拍X線片檢查構(gòu)建模型效果并進(jìn)行手術(shù)修復(fù)。

按體重編號(hào)，從隨機(jī)數(shù)字表產(chǎn)生36個(gè)隨機(jī)數(shù)，將隨機(jī)數(shù)從小到大排列后得序號(hào)R，并規(guī)定R=1～12者為單純纖維蛋白膠組 (A組)，R=13～24者為纖維蛋白膠復(fù)合自體骨髓組 (B組)，R=25～36者為纖維蛋白膠復(fù)合濃縮自體骨髓組 (C組)，每組12只。

濃縮骨髓復(fù)合纖維蛋白膠的制作及檢測(cè)麻醉動(dòng)物后，自兔雙側(cè)髂棘消毒，鋪無(wú)菌巾。雙側(cè)髂骨抽取共約10 ml骨髓。采集的骨髓經(jīng)過(guò)濾，去除脂肪、骨屑等。通過(guò)Ficoll密度梯度離心法，采用血液成分分離機(jī) (Eppendorf Centrifuge 5417R，德國(guó)Eppendorf公司)，4℃下3500 r/min(r=8.5 cm)離心8 min，去除紅細(xì)胞、多核細(xì)胞、血清和細(xì)胞碎片，收集到2～3 ml骨髓有核細(xì)胞懸液備用。

10只動(dòng)物的濃縮骨髓1 ml，取0.5 ml行血細(xì)胞計(jì)數(shù)，評(píng)價(jià)濃縮前后的有核細(xì)胞數(shù)量變化。另外0.5 ml濃縮骨髓做體外培養(yǎng)，隔日半量換液去除不貼壁細(xì)胞，9 d后對(duì)細(xì)胞集落形成單位計(jì)數(shù)，并行堿性磷酸酶染色評(píng)價(jià)其活性。

所用纖維蛋白膠由哈爾濱瀚邦醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn) ［藥品注冊(cè)證號(hào):國(guó)藥管械 (準(zhǔn))字2003第3650152號(hào)］。將濃縮骨髓無(wú)菌條件下與催化液混勻，使細(xì)胞終濃度為5×106/ml，分別將等量的主體膠溶液與含有濃縮骨髓的催化劑溶液加入雙腔注射器針管中。行骨髓注射前取少許濃縮骨髓纖維蛋白膠混合物行電鏡觀察，并行細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)及長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞檢驗(yàn)有無(wú)致瘤性。

濃縮骨髓復(fù)合纖維蛋白膠修復(fù)陳舊性骨缺損麻醉下用11號(hào)針頭穿入左側(cè)橈骨骨缺損區(qū)，針尖多點(diǎn)穿刺，并剝離瘢痕組織，使之松解，以利濃縮骨髓復(fù)合物均勻滲入，推動(dòng)共用的推液器使兩種溶液在雙腔注射器針頭部等量均勻混合后注射入兔橈骨缺損中，注入約2.0～2.5 ml［(10～15)×106］為C組，退出時(shí)邊退邊做輕度的前后抽動(dòng)，使穿刺通道被周圍組織填充。B組每只注射自體骨髓與纖維蛋白膠的復(fù)合物，A組單純注射纖維蛋白膠。術(shù)后無(wú)外固定，分籠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，術(shù)后每天肌注青霉素40萬(wàn)U 1次，連續(xù)3 d。

放射學(xué)評(píng)價(jià)各組分別于術(shù)后4、8、12周攝X線片觀察骨缺損區(qū)新骨形成情況。(投照距離1 m，投照條件46 kV，50 mA，曝光時(shí)間0.14 s)，觀察骨缺損愈合情況。所有照片依據(jù)Yang等［2］的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行放射學(xué)評(píng)分。

組織學(xué)評(píng)價(jià)嚴(yán)密觀察新西蘭大白兔的一般情況。術(shù)后4、8、12周處死動(dòng)物取標(biāo)本行硬組織切片，苦味酸-品紅染色及脫鈣后石臘包埋切片，HE染色觀察成骨情況，并觀察有無(wú)異物排斥反應(yīng)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，B、C兩組在8、12周2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的評(píng)分差異用2×2析因設(shè)計(jì)方差分析，各組各時(shí)間點(diǎn)的差異以LSD法行多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

濃縮后細(xì)胞數(shù)量的變化濃縮后，骨髓中有核細(xì)胞數(shù)量由 (4.5±1.0)×106/ml提高至 (29.0±2.3)×106/ml，細(xì)胞集落形成單位由 (178±98)/ml濃縮至 (424±145)/ml，堿性磷酸酶染色顯示為強(qiáng)陽(yáng)性 (圖1)。

細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)結(jié)果及長(zhǎng)期培養(yǎng)結(jié)果所有混合物細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)均為陰性。長(zhǎng)期培養(yǎng)，傳5代后均未見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)、生物學(xué)性狀改變。

復(fù)合物的電鏡觀察單純纖維蛋白膠固化后在電鏡下觀察見(jiàn)孔隙均勻，孔孔相通，有利于細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)交換 (圖2)。濃縮骨髓與纖維蛋白膠混合后，光鏡下見(jiàn)有核細(xì)胞與膠混合較均勻 (圖3);電鏡下見(jiàn)復(fù)合物表面布滿小孔，細(xì)胞黏附于其上 (圖4);4 h后電鏡觀察見(jiàn)細(xì)胞伸出偽足，與膠相容性良好 (圖5)。

圖2 纖維蛋白膠凝膠掃描 (×8500)Fig 2 Electron microscopy of the fabrin glue gelatination(×8500)

圖3 濃縮骨髓與纖維蛋白膠混合物 (×200)Fig 3 Compounds of enriched bone marrow and fibrin glue(×200)

圖4 濃縮骨髓與纖維蛋白膠混合物掃描 (×500)Fig 4 Electron microscopy of the compounds of enriched bone marrow and fibrin glue(×500)

圖5 骨髓有核細(xì)胞伸出偽足 (×2000)Fig 5 Pedes spurii of the bone marrow nucleated cells(×2000)

X線觀察術(shù)后4周，3組均未見(jiàn)骨缺損的修復(fù)。術(shù)后8周，C組見(jiàn)缺損區(qū)內(nèi)少許高密度影，兩斷端稍模糊，橈骨外部骨痂較多，缺損處內(nèi)側(cè)尺骨皮質(zhì)密度增高;B組見(jiàn)兩斷段有新生骨向骨缺損區(qū)生長(zhǎng)，缺損區(qū)內(nèi)側(cè)尺骨皮質(zhì)旁密度稍增高。術(shù)后12周，C組骨缺損處呈均勻一致高密度影，雙側(cè)骨皮質(zhì)連續(xù)，與斷端分界不清，骨缺損已塑型改造，髓腔貫通;B組亦見(jiàn)骨缺損的修復(fù)，骨痂較成熟，髓腔貫通不明顯。A組在觀察時(shí)間點(diǎn)內(nèi)均未見(jiàn)骨缺損的修復(fù) (圖6)。

圖6 術(shù)后各組X線片，因骨髓、纖維蛋白膠均不顯影，故3組均表現(xiàn)為骨缺損Fig 6 X-ray of each group after operation，bone defects were equally found in three groups due to the nonvisulization of both bone marrow and fibrin glue

術(shù)后8、12周，C組的 Yang氏評(píng)分分別為(9.348±0.364)和 (12.664±0.388)分，明顯高于B組的 (7.984±0.229)分 (F=40.167，P=0.001)和 (10.584±0.836)分 (F=20.3647，P=0.004)。B組(F=36.004，P=0.001)和C組(F=155.141，P=0.000)術(shù)后12周的Yang氏評(píng)分均明顯高于術(shù)后8周。時(shí)間點(diǎn)與濃縮與否之間存在的交互效應(yīng)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=1.978，P=0.185)。

硬組織切片觀察術(shù)后4周，因取標(biāo)本見(jiàn)無(wú)肉眼可見(jiàn)成骨，標(biāo)本被軟組織及纖維蛋白膠包裹，故未行硬組織切片。HE染色在C組見(jiàn)部分幼稚的骨組織與大量軟骨樣組織，較多纖維蛋白膠未降解 (圖7)(纖維蛋白膠由于在制片時(shí)流失，故表現(xiàn)為組織間的空白部分);B組見(jiàn)少許幼稚的骨組織與部分軟骨樣組織 (圖8)。8周時(shí)硬組織切片在C組可見(jiàn)橈骨斷端有部分成骨，為較幼稚的骨組織，可見(jiàn)新生血管 (圖9);B組亦見(jiàn)少量較幼稚的成骨 (圖10)。12周時(shí)見(jiàn)C組成骨較成熟 (圖11)，骨細(xì)胞排列較整齊，髓腔及新骨中仍有少許未降解的纖維蛋白膠參雜于其中，新骨在塑型中;而B(niǎo)組見(jiàn)斷端有較多成骨 (圖12)，仍有未降解纖維蛋白膠，成骨多為黃綠色的未礦化的類骨質(zhì)。A組各時(shí)間點(diǎn)均未見(jiàn)明顯成骨。

討 論

組織工程技術(shù)采用種子細(xì)胞復(fù)合支架材料，可構(gòu)建即時(shí)使用的骨修復(fù)材料，為骨缺損的修復(fù)提供全新的手段，具有廣泛的應(yīng)用前景［3］。Connolly等［4］采用自體骨髓注射成功治療20例脛骨骨不連，證實(shí)了自體骨髓的成骨作用。骨髓是唯一含有豐富定向性和誘導(dǎo)性骨祖細(xì)胞的組織，其所含有的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)性或成骨活性最強(qiáng)［5］。Hernigou等［6］將自體骨髓通過(guò)細(xì)胞分離器濃縮后注射入脛骨萎縮性骨不連患者，證明其有效性與移植骨髓中基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量有關(guān)，不經(jīng)濃縮處理，其基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量并不能達(dá)到治療骨不連的理想數(shù)目。

目前組織工程用種子細(xì)胞多采用體外采集培養(yǎng)擴(kuò)增方法，在臨床應(yīng)用時(shí)要使患者等待一段時(shí)間才能使用;且體外培養(yǎng)必須避免各種微生物的污染，對(duì)環(huán)境及實(shí)驗(yàn)條件要求較高［7］。而采用濃縮自體骨髓技術(shù)獲取骨髓有核細(xì)胞，對(duì)于臨床應(yīng)用而言，最大的優(yōu)勢(shì)在于即時(shí)、微創(chuàng)、有效性提高。

FG本身也是一種優(yōu)良的骨修復(fù)材料，Pei等［8］提取自體膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞與FG復(fù)合后旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)1個(gè)月，見(jiàn)細(xì)胞保持原有形態(tài)，將其與材料復(fù)合后成功修復(fù)了兔股骨髁的骨軟骨缺損。Abiraman等［9］將FG包被羥基磷灰石顆粒、生物活性玻璃陶瓷和磷酸鈣硅酸鈣系統(tǒng)分別植入鼠股四頭肌，以未包被材料作為對(duì)照，結(jié)果表明FG可能有骨誘導(dǎo)作用。FG可以促進(jìn)形成新的毛細(xì)血管及膠原沉積，這也將有利于骨形成［10］。

本研究通過(guò)使用可注射的纖維蛋白，在復(fù)合物混合均勻時(shí)即成凝膠，4h后電鏡觀察見(jiàn)細(xì)胞大量附著，伸出偽足，證實(shí)纖維蛋白膠與骨髓有核細(xì)胞相容性良好，為細(xì)胞提供了附著及生長(zhǎng)所必需的支架，避免了單純骨髓注射時(shí)有核細(xì)胞濃度下降。本研究利用纖維蛋白膠形成凝膠前兩種成分 (纖維蛋白原和凝血酶)均為流體的特點(diǎn)，將濃縮的骨髓有核細(xì)胞作為種子細(xì)胞先加入纖維蛋白原溶液中，這使種子細(xì)胞的復(fù)合變得簡(jiǎn)單易行，且細(xì)胞負(fù)載率高。

關(guān)于凝膠的降解問(wèn)題，文獻(xiàn)報(bào)道一般在1周開(kāi)始降解，1個(gè)月內(nèi)降解完畢，但這都是在血運(yùn)豐富的組織中得到的數(shù)據(jù)［11］。本研究觀察到，1個(gè)月時(shí)見(jiàn)大量纖維蛋白膠未降解，被新生骨組織包繞，在2個(gè)月時(shí)仍可見(jiàn)未降解的纖維蛋白膠，這可能與混合物被種植于硬的骨組織之間，延緩了降解有關(guān)。纖維蛋白膠的延緩降解有利于復(fù)合的細(xì)胞及細(xì)胞因子的釋放，從而與成骨同步起來(lái)［12］。

利用Yang評(píng)分代表局部骨缺損新骨形成的量，從而達(dá)到量化，可以進(jìn)行更準(zhǔn)確的比較。本研究通過(guò)放射學(xué)方法證明，對(duì)兔橈骨骨缺損8、12周時(shí)的成骨能力而言，濃縮骨髓復(fù)合纖維蛋白膠移植組的成骨能力＞單純骨髓復(fù)合纖維蛋白膠組＞單純纖維蛋白膠組。因?yàn)榻M織工程骨的成骨一般需要經(jīng)過(guò)軟骨內(nèi)化骨的過(guò)程，在1個(gè)月時(shí)骨的成熟不明顯，故在4周內(nèi)3組的區(qū)別不明顯。

綜上，本研究結(jié)果證實(shí)，濃縮自體骨髓復(fù)合纖維蛋白膠可修復(fù)兔橈骨骨缺損，且具有可注射使用、體內(nèi)成形、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，隨著研究的不斷深入，有望在骨不連、骨缺損修復(fù)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

［1］Martins AM，Pham QP，Malafaya PB，et al.Natural stimulus responsive scaffolds/cells for bone tissue engineering:influence of lysozyme upon scaffold degradation and osteogenic differentiation of cultured marrow stromal cells induced by CaP coatings［J］.Tissue Eng Part A，2009，15(8):1953-1963.

［2］Yang CY，Simmons DJ，Lozano R.The healing of grafts combining freeze-dried and demineralized allogeneic bone in rabbits ［J］.Clin Orthop Relat Res，1994(298):286-295.

［3］Betz OB，Betz VM，Abdulazim A，et al.Healing of large segmental bone defects induced by expedited bone morphogenetic protein-2 gene-activated，syngeneic muscle grafts［J］.Hum Gene Ther，2009，20(12):1589-1596.

［4］Connolly JF，Guse R，Tiedeman J，et al.Autologous marrow injection as a substitute for operative grafting of tibial nonunions ［J］.Clin Orthop Relat Res，1991(266):259-270.

［5］Lacerda SA，Lanzoni JF，Bombonato-Prado KF，et al，Osteogenic potential of autogenous bone associated with bone marrow osteoblastic cells in bony defects:a histomorphometric study ［J］.Implant Dent，2009，18(6):521-527.

［6］Hernigou P，Poignard A，Beaujean F，et al，Percutaneous autologous bone-marrow grafting for nonunion.Influence of the number and concentration of progenitor cells ［J］.J Bone Joint Surg Am，2005，87(7):1430-1437.

［7］Lee K，Goodman SB.Cell therapy for secondary osteonecrosis of the femoral condyles using the Cellect DBM System:a preliminary report［J］.J Aarthroplasty，2009，24(1):43-48.

［8］Pei M，He F，Boyce BM，et al，Repair of full-thickness femoral condyle cartilage defects using allogeneic synovial cell-engineered tissue constructs ［J］.Osteoarthritis Carti-lage，2009，17(6):714-722.

［9］Abiraman S，Varma HK，Umashankar PR，et al.Fibrin glue as an osteoinductive protein in a mouse model［J］.Biomaterials，2002，23(14):3023-3031.

［10］Ornelas L，Padilla L，Di Silvio M，et al.Fibrin glue:an alternative technique for nerve coaptation-Part I.Wave amplitude，conduction velocity，and plantar-length factors ［J］.J Reconstr Microsurg，2006，22(2):119-122.

［11］Yamada Y，Boo JS，Ozawa R，et al，Bone regeneration following injection of mesenchymal stem cells and fibrin glue with a biodegradable scaffold ［J］.J Craniomaxillofac Surg，2003，31(1):27-33.

［12］Itosaka H，Kuroda S，Shichinohe H，et al，F(xiàn)ibrin matrix provides a suitable scaffold for bone marrow stromal cells transplanted into injured spinal cord:a novel material for CNS tissue engineering ［J］.Neuropathology，2008，29(3):248-257.

圖1 堿性磷酸酶染色 (×40)Fig 1 Alkaline phosphatase staining(×40)

圖7 C組4周 (HE，×200)Fig 7 Four weeks in group C(HE， ×200)

圖8 B組4周 (HE，×200)Fig 8 Four weeks in group B(HE，×200)

圖9 C組8周 (Van Gieson，×1)Fig 9 Eight weeks in group C(van Gieson， ×1)

圖10 B組8周 (Van Gieson，×1)Fig 10 Eight weeks in group B(van Gieson， ×1)

圖11 C組12周 (Van Gieson，×1)Fig 11 Twelve weeks in group C(van Gieson， ×1)

圖12 B組12周 (Van Gieson，×1)Fig 12 Twelve weeks in group B(van Gieson， ×1)