陳順平 劉 偉 余英豪 劉蘇英 陳 霓 謝飛來

尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，且容易復(fù)發(fā)，遺傳學(xué)研究表明尿路上皮癌容易發(fā)生染色體畸變［1］?，F(xiàn)今，隨著遺傳學(xué)在臨床方面的廣泛應(yīng)用，尿路上皮腫瘤遺傳學(xué)改變正逐漸成為臨床病理診斷的關(guān)注焦點(diǎn)，而FISH作為臨床常用的遺傳學(xué)檢測技術(shù)，可直接用于檢測細(xì)胞核染色體的改變［2］。目前在膀胱腫瘤方面研究較多是通過檢測尿液細(xì)胞學(xué)染色體改變情況，以判斷膀胱尿路上皮癌的存在與復(fù)發(fā)，而對(duì)于組織學(xué)方面研究較少。本文應(yīng)用FISH技術(shù)，對(duì)膀胱不同級(jí)別尿路上皮乳頭狀瘤樣病變組織進(jìn)行檢測，了解3、7、17號(hào)染色體及p16基因在這些病變中的非整倍性情況，以期對(duì)膀胱尿路上皮腫瘤的病理學(xué)診斷及鑒別診斷提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2009年1月～2010年12月、在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院手術(shù)切除或膀胱鏡活檢的膀胱腫瘤石蠟包埋組織標(biāo)本33例，其中男性16例，女性17例，年齡32～75歲，平均48.5歲。按不同乳頭狀瘤樣病變類型分為5組:腺性膀胱炎6例(B組)，內(nèi)翻性乳頭狀瘤6例(C組)，低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤7例(D組)，非浸潤性膀胱乳頭狀尿路上皮癌5例(E組)，浸潤性膀胱尿路上皮癌9例(F組)。以10例正常膀胱黏膜組織作為對(duì)照組(A組)。

1.2 主要儀器和試劑

酸性亞硫酸鈉為美國Simga產(chǎn)品，蛋白酶K為美國羅氏產(chǎn)品，探針(GLP9P16、CSP3、CSP7、CSP17 探針)購自北京金菩嘉公司。Olympus BX51型熒光顯微鏡、Dake原位雜交儀、電熱恒溫水槽、隔水式恒溫培養(yǎng)箱等。

1.3 FISH檢測方法

主要步驟如下:①石蠟組織切片3 μm，置于涂膠玻片上并浸于二甲苯中脫蠟至水;②50℃下30%酸性亞硫酸鈉處理組織切片30～40 min;③室溫下2×SSC漂洗3 min×2次;④組織上滴加自行配制的即用型蛋白酶K，37℃預(yù)熱的孵育盒中消化25～35 min;⑤室溫下2×SSC漂洗3 min×2次，乙醇梯度脫水固定，自然干燥;⑥避光環(huán)境下雜交區(qū)域滴加探針混合液(7 μl雜交緩沖液、1 μl去離子水和 2 μl探針)，83℃自動(dòng)雜交儀中變性6 min后置37℃過夜雜交。⑦洗滌:移去蓋玻片，46℃下2×SSC漂洗10 min×2次，0.1%NP-40溶液中5 min。待玻片干燥后加DAPI復(fù)染液，置暗盒中復(fù)染數(shù)分鐘。OLYMPUS BX51熒光顯微鏡DAPI/FIFC/RHOD三色濾光鏡下觀察期間細(xì)胞熒光雜交信號(hào)。

1.4 結(jié)果判定

①信號(hào)判斷:由1名醫(yī)師和1名技術(shù)員共同觀察記錄結(jié)果。每例分析100個(gè)散在細(xì)胞，以細(xì)胞雜交率＞80%為有效標(biāo)本，細(xì)胞重疊、破損及雜交信號(hào)微弱細(xì)胞核不計(jì)數(shù)，細(xì)胞內(nèi)雜交信號(hào)互相靠近者計(jì)為1個(gè)信號(hào)。確定單個(gè)細(xì)胞染色體異常的標(biāo)準(zhǔn)為:單個(gè)細(xì)胞信號(hào)數(shù)≥3為擴(kuò)增;≤1為信號(hào)缺失。②閾值建立:閾值=平均數(shù)(M)+3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，以正常組為標(biāo)準(zhǔn)建立域值如下:CSP3≥7個(gè)異常細(xì)胞為擴(kuò)增;CSP7≥8個(gè)異常細(xì)胞為擴(kuò)增;CSP17≥6個(gè)異常細(xì)胞為擴(kuò)增;p16≥6個(gè)異常細(xì)胞為擴(kuò)增。p16基因≥70個(gè)細(xì)胞信號(hào)缺失為基因缺失。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組病例3、7、17染色體及p16擴(kuò)增率與缺失率

浸潤性尿路上皮癌(F組)與其他各組(A～E組)3、7、17染色體及p16擴(kuò)增率和缺失率比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01);其他各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見表1。

2.2 各組病例4種探針聯(lián)合檢測的異常情況

4種探針聯(lián)合檢測≥2個(gè)指標(biāo)異常出現(xiàn)率，浸潤性尿路上皮癌(F組)為100.00%，低度惡性潛能乳頭狀尿路上皮腫瘤(D組)為14.29%，非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌(E組)為20.00%，F(xiàn)組與其他5組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)，見表1。

表1 各組膀胱組織多基因檢測結(jié)果(例，%)

2.3 擴(kuò)增或缺失病例信號(hào)差異分析

9例浸潤性膀胱尿路上皮癌中，3、7、17染色體均為非整倍性擴(kuò)增，擴(kuò)增率為100.00%(9/9)，且染色體非整倍性情況具有多樣性;信號(hào)點(diǎn)數(shù)較為密集，提示高擴(kuò)增。低度惡性潛能乳頭狀尿路上皮腫瘤和非浸潤性膀胱尿路上皮癌染色體僅各1例出現(xiàn)染色體異常，而且為低擴(kuò)增或p16基因部分缺失。

2.4 FISH技術(shù)檢測判斷惡性尿路上皮腫瘤的敏感性與特異性

≥2個(gè)指標(biāo)異常浸潤性尿路上皮癌診斷敏感性為81.82%，特異性為91.67%;≥2個(gè)指標(biāo)異常非浸潤性尿路上皮癌診斷敏感性為9.10%，特異性為64.29%。

3 討論

尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，復(fù)發(fā)率高達(dá)70%，在初診時(shí)大部分為非浸潤性癌，即使經(jīng)過切除腫瘤聯(lián)合化療藥物或卡介苗膀胱灌注治療后，仍有30% ～40%的患者復(fù)發(fā)［3］，10% ～15%的復(fù)發(fā)性非浸潤性尿路上皮癌會(huì)進(jìn)展為浸潤性癌或轉(zhuǎn)移性癌［4］。因此，對(duì)膀胱腫瘤的早期診斷以及對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)的監(jiān)測非常重要，許多研究者都把目光投向分子遺傳學(xué)方面，而FISH技術(shù)是現(xiàn)今最常應(yīng)用于尿路上皮癌診斷的分子遺傳學(xué)研究方法之一，該方法具有很高的靈敏性及特異性，直觀性和重復(fù)性好，2001年7月被FDA批準(zhǔn)用于膀胱腫瘤的檢測，其主要用于染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變的研究。Sandberg等［5］在1994年對(duì)泌尿腫瘤染色體研究認(rèn)為，尿路上皮癌易發(fā)生染色體改變，其中包括結(jié)構(gòu)畸變和染色體數(shù)目異常，常見結(jié)構(gòu)畸變?nèi)旧w有3、9、1、5、11、21、17 號(hào)染色體，染色體數(shù)異常見于 3、9、7、10、11、Y、1、8、17、15 號(hào)染色體。目前臨床上用于診斷尿路上皮癌的常用染色體主要有:3、7、9、17號(hào)染色體。此外，尿路上皮癌的發(fā)展與染色體不穩(wěn)定性也緊密相關(guān)，特別是3、7 及17 號(hào)染色體的非整倍性［4，6］。目前國內(nèi)外有關(guān)FISH技術(shù)應(yīng)用于膀胱尿路上皮腫瘤的大規(guī)模的臨床應(yīng)用研究，都局限于尿路上皮癌的尿液細(xì)胞學(xué)檢測，而應(yīng)用于膀胱尿路上皮腫瘤不同病變期組織學(xué)染色體改變情況的研究尚未見報(bào)道。鑒于不同類型膀胱尿路上皮腫瘤病變，特別是乳頭狀增生性病變?cè)谌粘２±碓\斷中既多見，而有時(shí)又難以很好把握，特別是個(gè)別病例在同一張切片中會(huì)同時(shí)見到良性乳頭狀增生至浸潤性癌的改變，因此，我們應(yīng)用FISH技術(shù)，對(duì)不同類型的膀胱尿路上皮腫瘤組織進(jìn)行FISH檢測，一方面初步了解染色體在膀胱尿路上皮腫瘤組織學(xué)中的非整倍性情況，同時(shí)希望對(duì)膀胱尿路上皮腫瘤的日常病理診斷及鑒別診斷提供幫助。

本研究選用3、7、17號(hào)染色體和9號(hào)染色體部的p16基因這4種特異性DNA探針，對(duì)33例膀胱尿路上皮腫瘤組織、10例正常對(duì)照膀胱組織進(jìn)行FISH檢測，通過檢測染色體的遺傳學(xué)改變，來評(píng)估FISH技術(shù)在膀胱尿路上皮腫瘤病理診斷中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3、7、17染色體及p16擴(kuò)增率與缺失率方面，浸潤性尿路上皮癌組與其他各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;其他各組(A～E組)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;4種探針聯(lián)合檢測中有≥2個(gè)指標(biāo)同時(shí)出現(xiàn)異常，浸潤性尿路上皮癌(F組)占100.00%、低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤(D組)為14.29%、非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌(E組)為20.00%，F(xiàn)組與其他各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;≥2個(gè)指標(biāo)同時(shí)異常診斷浸潤性尿路上皮癌敏感性為81.82%、特異性為91.67%，這與FISH應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)方面報(bào)道結(jié)果相近［7～9］;但是≥2個(gè)指標(biāo)異常診斷非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌敏感性低，僅20%出現(xiàn)基因異常改變。通過進(jìn)一步分析，我們發(fā)現(xiàn)，不同程度不同染色體的非整倍性及p16基因擴(kuò)增及缺失存在與不同分期的尿路上皮腫瘤中，如低度惡性潛能組及內(nèi)翻性乳頭狀瘤組亦出現(xiàn)基因異常病例。但隨著組織病變級(jí)別的增高，染色體非整倍性更具多樣性，信號(hào)點(diǎn)類型表現(xiàn)更為復(fù)雜且擴(kuò)增率更高，而達(dá)到浸潤性癌時(shí)，3、7、17染色體均為非整倍性擴(kuò)增，擴(kuò)增率達(dá)100%，這與Bollmann等［10］的研究結(jié)果相近。

由此我們認(rèn)為:①膀胱乳頭狀尿路上皮病變出現(xiàn)染色體非整倍性擴(kuò)增，且非整倍性情況具多樣性;信號(hào)點(diǎn)密集幾乎均見于浸潤性尿路上皮癌;②不同類型的膀胱乳頭狀尿路上皮病變，均可能出現(xiàn)不同程度不同染色體的非整倍性及p16基因擴(kuò)增及缺失，但良性及非浸潤性癌非整倍性的多樣性及信號(hào)點(diǎn)類型復(fù)雜程度較低;③即使沒有出現(xiàn)染色體非整倍性擴(kuò)增的病例，亦不能排除膀胱尿路上皮癌的診斷，而一旦出現(xiàn)FISH陽性改變亦給予高度重視，及時(shí)進(jìn)行必要的干預(yù)或密切隨訪;④這4組探針聯(lián)合檢測，可用于尿路上皮癌術(shù)后病例的監(jiān)測，但并不能作為早期癌的敏感篩查方法。

由于本研究病例數(shù)相對(duì)偏少，特別是幾例病理組織學(xué)顯示良性病變而出現(xiàn)基因異常的病例，目前臨床意義尚不明確，我們將進(jìn)行密切的隨訪，同時(shí)有必要進(jìn)行尿液脫落細(xì)胞學(xué)FISH檢測與病理組織學(xué)對(duì)比的大宗病例對(duì)照研究。

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