吳升偉,包懷恩,葛 爽,李小燕

2.貴州省疾病預(yù)防控制中心,貴陽 550004

弓形蟲病是由剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)感染引起的嚴(yán)重危害健康的一種人獸共患性疾病,其病原體弓形蟲是重要的專性細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會性致病原蟲,可以感染包括人在內(nèi)的所有哺乳動物、鳥類和爬行動物,并在人和多種動物的有核細(xì)胞內(nèi)發(fā)育和繁殖,從而引起宿主細(xì)胞和組織的炎癥和壞死等非特異性病變。對人群中弓形蟲感染的流行病學(xué)調(diào)查資料顯示,全世界大約有25%～50%的人受到感染,我國的感染率為5%～10%[1]。弓形蟲具有親神經(jīng)性的特點(diǎn),腦組織是弓形蟲最易侵犯的部位之一。有報(bào)道稱90%以上的全身性弓形蟲病患者死于弓形蟲腦部感染及其誘發(fā)的弓形蟲腦炎[2]。除此之外,近年發(fā)現(xiàn)弓形蟲感染是艾滋病患者最常見的機(jī)會性感染之一,有10%～30%艾滋病患者可并發(fā)弓形蟲腦炎,并且是其死亡的主要原因之一[3]。

弓形蟲Prugniaud株是人體和動物感染的優(yōu)勢蟲株之一[4],其毒力弱于RH強(qiáng)毒株,該蟲有速殖子和緩殖子兩種狀態(tài),前者有較強(qiáng)侵襲性,后者容易在宿主腦組織中形成包囊。為觀察這株弓形蟲在宿主弓形蟲性腦病中的病理變化及機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)以腹腔感染途徑向ICR小鼠注入弓形蟲Prugniaud株包囊,建立小鼠感染模型,應(yīng)用常規(guī)組織病理學(xué)方法、免疫組織化學(xué)法及PCR檢測弓形蟲特異性基因的方法,觀察小鼠腦組織病理變化與蟲體的關(guān)系及弓形蟲包囊在腦的形成和存在時(shí)間,以為弓形蟲腦病組織病理學(xué)診斷提供依據(jù),并為進(jìn)一步研究腦組織中包囊活化的發(fā)生機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 6～8周齡SPF級ICR雌性小鼠,體重20～25g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司(小鼠許可證編號SCXK(京)2006-0009)。

1.2 蟲株 弓形蟲Prugniaud株由蚌埠醫(yī)學(xué)院孫新教授和南京醫(yī)科大學(xué)陳錫慰教授惠贈,本室在昆明小鼠體內(nèi)傳代保種。

1.3 主要試劑 兔抗弓形蟲多克隆抗體購自美國ViroStat公司,兔抗體免疫組化試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司,DNA提取試劑盒及DNA marker購自寶生物工程(大連)有限公司,瓊脂糖購自Electrop Grade西班牙公司,2×PCR Green mix購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.4 引物的合成 根據(jù)GenBank上弓形蟲RH株(序列號：AF179871.1)B1基因序列,利用DNAMAN軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),上游引物：5′-GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3′,下游引物 ：5′-TCT TTAAAGCGT TCGTGGTC-3′,擴(kuò)增長度194bp,引物由上海生物工程有限公司合成。

1.5 實(shí)驗(yàn)動物感染 將感染Prugniaud株弓形蟲的小鼠用頸椎脫臼法處死,無菌狀態(tài)下取小鼠腦組織,放入加有 PBS的勻漿器內(nèi)制備成腦組織勻漿液,取10μ L勻漿液平鋪在玻片上,于顯微鏡下計(jì)數(shù)包囊,并于試管內(nèi)用無菌PBS調(diào)整至10個(gè)/0.5mL包囊,準(zhǔn)備作感染動物用。購買的健康ICR小鼠(雌性,20～25g)經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)后,予感染組小鼠腹腔注射腦組織勻漿液0.5mL/只鼠,對照組小鼠腹腔注射同等量的PBS,其中感染組小鼠接種40只,對照組小鼠22只,分別分籠飼養(yǎng),每籠5～6只,正常取食及飲水。

1.6 感染小鼠發(fā)病情況及指標(biāo)觀察 感染后每天觀察小鼠,記錄發(fā)病情況。于腹腔接種后第 5d、10d、15d、20d、25d、30d、60d、90d、120d、150d 及180d用頸椎脫臼法隨機(jī)處死3只感染組小鼠和2只對照組小鼠,取部分小鼠腦組織于10%中性甲醛溶液固定24h,按常規(guī)方法進(jìn)行脫水、石蠟包埋,制作4μ mol/L切片,分別作HE染色和免疫組織化學(xué)檢測;同時(shí)取部分組織用勻漿器研磨后DNA提取試劑盒抽提組織DNA,具體操作方法見說明書。

1.7 免疫組化檢測 石蠟切片用二甲苯常規(guī)脫蠟及入水。染色前用PBS浸泡石蠟切片10 min,然后入3%H2O2-甲醇液中浸泡10 min,PBS洗后加一滴封閉液于組織切片上孵育10min,吸干液體后加適量兔抗弓形蟲多克隆抗體(1∶200)濕盒內(nèi)孵育30～60min,PBS洗后加一滴生物素化抗兔IgG孵育10min,PBS洗后加一滴鏈親和素標(biāo)記HRP孵育10min,PBS洗后DAB室溫顯色2～5min后自來水充分沖洗,蘇木素復(fù)染,鹽酸酒精分化后氨水泛藍(lán),最后乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、鏡檢。陰性對照是用正常PBS代替弓形蟲多克隆抗體,其余步驟同上。結(jié)果判定：陽性反應(yīng)為在抗原定位處見到棕黃或棕褐色沉淀。

1.8 對不同感染時(shí)間小鼠腦組織用PCR擴(kuò)增弓形蟲B1基因特異性片段檢測 反應(yīng)體系為25μ L,其中 2×PCR Green mix 12.5μ L,無菌雙蒸水 9.5μ L,上下游引物(10μ mol/L)各 1μ L,模板 1μ L,上述反應(yīng)混合物先在94℃5 min預(yù)變性,然后進(jìn)入循環(huán),94℃30 s,58℃45 s,72℃1min,30個(gè)循環(huán),72℃延伸7 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物的鑒定：取10μ L擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 mmol/L溴乙錠)上,100 V,30 min,紫外檢測儀器下觀察,200 bp附近出現(xiàn)條帶判定陽性。

2 結(jié) 果

2.1 感染小鼠發(fā)病情況及癥狀 感染弓形蟲包囊后第6d小鼠開始出現(xiàn)食欲減退、聳毛、怠惰、抖動、體重減輕、腹脹、腹瀉及死亡等,同時(shí)15%小鼠出現(xiàn)死亡,剖檢死亡小鼠發(fā)現(xiàn)腹水和肝脾明顯腫大,腹水檢測發(fā)現(xiàn)弓形蟲速殖子(圖1)。從第20d開始,小鼠逐漸進(jìn)入恢復(fù)期,飲食、飲水開始恢復(fù),活動開始增加,至第30d,小鼠表現(xiàn)為活動增加、皮毛光滑、食欲好轉(zhuǎn),體重開始增加。對照組小鼠無異常。

圖1 箭頭所示為弓形蟲感染小鼠腹水中速殖子,周圍可見假包囊,右下角為標(biāo)尺,代表 10μ m(Gimesa染色,×1 000)Fig.1 The arrow shows Toxopalsa gondii tachyzoite from peritoneal fluid smear of infected mice,surrounding pseudocyst can be seen,and lowright was scale,which was 10μ m(Gimesa staining,×1 000)

2.2 小鼠的腦組織病理學(xué)動態(tài)觀察 在上述時(shí)間對腦組織進(jìn)行病理切片,作HE染色,鏡檢結(jié)果如下：感染5d時(shí)腦組織未見明顯病變。感染10d時(shí)腦組織見明顯的神經(jīng)元變性,神經(jīng)元周圍出現(xiàn)多個(gè)少突膠質(zhì)細(xì)胞圍繞即衛(wèi)星現(xiàn)象,可見小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬死亡的神經(jīng)元即噬神經(jīng)現(xiàn)象,未見典型的弓形蟲速殖子。感染15d時(shí)偶見小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生形成的膠質(zhì)結(jié)節(jié),并見一個(gè)較小的弓形蟲包囊。感染20d時(shí)神經(jīng)膠質(zhì)結(jié)節(jié)、衛(wèi)星現(xiàn)象、噬神經(jīng)現(xiàn)象及弓形蟲包囊更加多見,珠網(wǎng)膜下腔炎癥細(xì)胞明顯增多,以淋巴細(xì)胞為主,同時(shí)見少量單核細(xì)胞。感染25d時(shí)見小血管擴(kuò)張充血,中等量的炎癥細(xì)胞圍血管浸潤形成血管套,即袖套現(xiàn)象(圖2-A);神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞彌漫性增生形成的結(jié)節(jié)明顯增多,腦實(shí)質(zhì)及血管周邊可見多個(gè)弓形蟲包囊,包囊周圍可見噬神經(jīng)現(xiàn)象、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞彌漫性增多等改變(圖2-B和2-C);同時(shí)可見腦軟化灶(圖2-D),其內(nèi)見腦組織基質(zhì)消失,崩解的核碎片及增多的淋巴細(xì)胞;珠網(wǎng)膜下腔內(nèi)血管擴(kuò)張充血,以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞彌漫性增多(圖2-E)。感染30d時(shí)病變與感染25d時(shí)的相似。感染60d時(shí)腦組織包囊和袖套現(xiàn)象依然明顯,弓形蟲包囊較感染30d時(shí)直徑明顯增加,囊內(nèi)見大量緩殖子,珠網(wǎng)膜下腔見明顯炎癥細(xì)胞。感染90d時(shí)珠網(wǎng)膜下腔見散在炎癥細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及成垂直樣排列的新生毛細(xì)血管,似肉芽組織(圖2-F)。120d后袖套現(xiàn)象開始不明顯,但仍可見明顯的弓形蟲包囊、神經(jīng)元變性及膠質(zhì)細(xì)胞增生形成結(jié)節(jié),珠網(wǎng)膜下腔炎癥反應(yīng)較前明顯減輕。感染150d和180d時(shí)病理變化與120d時(shí)類似,珠網(wǎng)膜下腔仍可見少量炎癥細(xì)胞浸潤。對照組小鼠腦組織病理切片HE染色未見任何病理學(xué)變化。

圖2 弓形蟲感染小鼠腦組織病理學(xué)改變A：箭頭所示為弓形蟲感染第25d袖套現(xiàn)象(HE染色,×200)B：黑色箭頭所示為弓形蟲感染第25d弓形蟲包囊,紅色箭頭為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞聚集(HE染色,×400);C：黑色箭頭所示為弓形蟲感染第25d弓形蟲包囊,紅色箭頭顯示噬神經(jīng)現(xiàn)象(HE染色,×400);D：箭頭所示為感染第25d腦軟化灶(HE染色,×200);E：弓形蟲感染第25d珠網(wǎng)膜下腔見炎癥細(xì)胞浸潤及血管擴(kuò)張充血(HE染色,×200);F：弓形蟲感染90d珠網(wǎng)膜下腔肉芽組織(HE染色,×200)Fig.2 Histopathological changes of the brain in mice infected with Toxoplasma gondiiA ：Arrow show sleeve cuffing at 25d post-infection(HE staining,×200);B：Black arrow show Toxoplasma cyst,and red arrow show neuroglial cell aggregation at 25d post-infection(HE staining,×400);C ：Black arrow show Toxoplasma cyst,and red arrow show neruonophagia at 25d post-infection(HE staining,×400);D：Arrow show cerebral malacia change at 25d post-infection(HE staining,×200);E：Inflammatory cell infiltration,hemangiectasia and hyperaemia on cavitas subarachnoidealis at 25d post-infection(HE staining,×200);F：Granulation tissue on cavitas subarachnoidealis at 90d post-infection(HE staining,×200)

圖3 弓形蟲感染小鼠腦組織免疫組織化學(xué)檢測(IHC,×400)A：弓形蟲多克隆抗體在感染第10d腦組織中的表達(dá);B：弓形蟲感染第60d腦組織出現(xiàn)弓形蟲包囊,可見緩殖子(箭頭所示為包囊)Fig.3 Immunohistochemistry test of the brain in mice infected by Toxoplasma gondii(IHC,×400)A：Expression of Toxoplasmagondii polyclonal antibody on the brain at 10d post-infection;B：Toxoplasma cysts including bradyzoite on the brain at 60d post-infection(the arrow shows a cyst)

2.3 免疫組織化學(xué)檢測 對腦組織石蠟切片常規(guī)進(jìn)行脫蠟、入水及染色,以腦組織弓形蟲抗原定位處出現(xiàn)棕褐色沉淀判為陽性。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)感染第5d時(shí)腦組織切片未見棕褐色沉淀,感染第10d時(shí)腦組織細(xì)胞胞漿和胞核出現(xiàn)棕褐色顆粒狀物質(zhì)(圖3-A),說明腦組織中存在弓形蟲蟲體或弓形蟲抗原。從感染15d起腦組織中棕褐色物質(zhì)漸減少并出現(xiàn)染成淡黃色的弓形蟲包囊(圖3-B),可清楚看見囊內(nèi)緩殖子,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束均能看見弓形蟲包囊。對照組小鼠腦組織未見任何陽性反應(yīng)。

2.4 不同感染時(shí)間小鼠腦組織中弓形蟲B1基因特異性片段PCR擴(kuò)增結(jié)果 從腦組織勻漿液中提取組織DNA,用PCR儀進(jìn)行特異性片段擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳顯示在感染第5d時(shí)腦組織DNA中未發(fā)現(xiàn)目的條帶,而從感染第10d至第180d,在約200bp大小處見一明顯條帶,考慮為弓形蟲B1基因特異性片段(圖4),說明在這些組織中存在弓形蟲蟲體,而對照組小鼠腦組織未擴(kuò)增出弓形蟲B1基因特異性片段。

3 討 論

以往的研究證明弓形蟲速殖子可以侵入腦神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等,并在其內(nèi)成囊,但對于弓形蟲感染所致的腦組織病理損害未見詳盡描述。本次研究發(fā)現(xiàn)自Prugniaud株弓形蟲感染第10d開始小鼠腦組織內(nèi)即出現(xiàn)神經(jīng)元變性、衛(wèi)星現(xiàn)象及噬神經(jīng)現(xiàn)象等病理改變,第15d起出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞聚集,第20d起珠網(wǎng)膜下腔發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤,25d起出現(xiàn)炎癥細(xì)胞圍血管浸潤即袖套現(xiàn)象,第90d時(shí)在珠網(wǎng)膜下腔見肉芽組織,可見弓形蟲Prugniaud株入侵腦組織可直接損傷神經(jīng)細(xì)胞,甚至可造成細(xì)胞的變性壞死,并隨時(shí)間延長引起小鼠非特異性腦膜腦炎的病理改變,隨之逐漸開始了炎癥修復(fù)過程。在感染第10d時(shí),腦組織免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)了弓形蟲抗原,同時(shí)用PCR方法檢測到弓形蟲B1基因特異性DNA,進(jìn)一步證明了在感染10d時(shí)弓形蟲速殖子已經(jīng)進(jìn)入腦組織,而這與病變的發(fā)生有時(shí)間上的相關(guān)性;常規(guī)組織病理學(xué)和免疫組化檢測均從感染第15d標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)弓形蟲包囊,且包囊直徑隨感染時(shí)間的增加漸增大,內(nèi)含緩殖子也漸增多,直至感染第180d仍能找到弓形蟲包囊,這些動態(tài)變化提示了腦組織的病理損傷主要與弓形蟲速殖子有關(guān),之后表現(xiàn)為病變逐漸修復(fù),而弓形蟲包囊卻長期存在腦組織。然而,在感染第10d時(shí)HE染色片上我們未見明顯的弓形蟲包囊或速殖子,這可能是由于包囊尚未形成,而速殖子較小且經(jīng)過固定脫水,難以辨別出組織切片中蟲體,尤其在核內(nèi)感染時(shí),不易和核內(nèi)染色質(zhì)區(qū)別。

圖4 不同感染時(shí)間小鼠腦組織中PCR擴(kuò)增弓形蟲B1基因片段電泳圖M：marker,1：感染第 5d腦組織,2：感染第 10d腦組織,3：感染第 15d腦組織,4：感染第20d腦組織,5：感染第25d腦組織,6：感染第 30d腦組織,7：感染第 60d腦組織,8：感染第90d腦組織,9：感染第120d腦組織,10：感染第150d腦組織,11：感染第180d腦組織Fig.4 B1 gene identification for brain tissue by PCR in different timeM ：100bp lander,1：brain tissue 5d post-infection,2：brain tissue 10d post-infection,3：brain tissue15d post-infection,4：brain tissue 20d post-infection,5：brain tissue25d post-infection,6：brain tissue 30d post-infection,7：brain tissue 60d post-infection,8：brain tissue 90d post-infection,9：brain tissue 120d post-infection,10：brain tissue 150d post-infection,11：brain tissue 180d post-infection

本實(shí)驗(yàn)觀察到的包囊形成與學(xué)者Ferguson[5]應(yīng)用電鏡觀察到的結(jié)果基本相似,即第11d出現(xiàn)早期包囊,3～6個(gè)月包囊直徑增大,直至22個(gè)月均可見包囊,實(shí)驗(yàn)中15d才看見包囊可能是由于檢測手段及取材時(shí)間不同導(dǎo)致;組織病理學(xué)變化與杜重波[6]等觀察到的自然弱毒株引起小白鼠腦組織病理改變是不完全相同的,后者在感染第7d即可發(fā)現(xiàn)袖套現(xiàn)象,且未見明顯的神經(jīng)細(xì)胞軟化壞死的表現(xiàn),而本實(shí)驗(yàn)在感染第25d時(shí)才觀察到袖套現(xiàn)象,并見明顯的腦軟化灶,這些差別的可能原因是所用小鼠品系、級別及蟲株不同引起。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)感染小鼠第6d開始出現(xiàn)食欲減退、聳毛、腹瀉等癥狀,同時(shí)出現(xiàn)15%的死亡,第20d起開始恢復(fù),第30d時(shí)如同正常小鼠,這些臨床癥狀的出現(xiàn)與弓形蟲速殖子侵入內(nèi)臟器官引起這些器官嚴(yán)重的病理改變有明顯關(guān)系(內(nèi)臟的病理改變見另文描述)。

免疫組化染色時(shí)發(fā)現(xiàn)包囊著色較速殖子淺,這與劉俊燕等[7]的觀察結(jié)果是一致的,可能原因是由于所用的兔抗弓形蟲多克隆抗體是針對 RH速殖子的,而Prugniaud株和RH株產(chǎn)生的抗原是有一定區(qū)別的;同時(shí)包囊囊壁較厚且蟲體排列緊密致使弓形蟲抗原不易暴露所致。腦內(nèi)包囊的長期存在對于免疫力受抑制的患者如艾滋病患者、器官移植和癌癥放化療患者可能造成嚴(yán)重危害,是弓形蟲病復(fù)發(fā)的根源。

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