馬 磊,顏其貴,2,萬(wàn) 莉,張 琦,楊 映,謝智勇

2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)屬于腸桿菌科腸道桿菌屬,廣泛存在于人和動(dòng)物腸道、呼吸道以及水、土壤、農(nóng)產(chǎn)品和林產(chǎn)品中。正常情況下,本菌不會(huì)引起動(dòng)物發(fā)病,但是當(dāng)機(jī)體抵抗力下降或本菌大量增殖時(shí),就會(huì)引起動(dòng)物發(fā)病甚至暴發(fā)性流行[1],肺炎克雷伯氏菌被列為條件致病菌,是目前公認(rèn)的導(dǎo)致動(dòng)物和人類發(fā)病的克雷伯氏菌[2-3]。其可引起支氣管炎、肺炎,泌尿系統(tǒng)和創(chuàng)傷感染,甚至敗血癥、腦膜炎、腹膜炎[3]等。近年來(lái),雖然中國(guó)養(yǎng)殖業(yè),尤其是經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)得到了迅猛發(fā)展,但由于養(yǎng)殖戶的管理水平、養(yǎng)殖場(chǎng)的硬件和軟件設(shè)施不能進(jìn)行規(guī)范化管理等原因,已經(jīng)有多起由該菌引起的人畜感染的報(bào)道,且已日益被關(guān)注[4]。

1 材料與方法

2010年10月四川省某竹鼠人工養(yǎng)殖場(chǎng)竹鼠陸續(xù)死亡情況,病情無(wú)大小、性別差異。典型癥狀為突然起病,有寒戰(zhàn)和咳嗽,甚至出現(xiàn)意識(shí)障礙伴躁動(dòng)不安等嚴(yán)重癥狀。剖檢后發(fā)現(xiàn)腹腔有大量膠胨樣積液,腸道嚴(yán)重臌氣,肺臟有實(shí)變和充血,肝臟腫大,腎臟有出血點(diǎn)。累積剖檢瀕死病鼠23只。

酵母浸出物、胰蛋白胨等試劑購(gòu)自Sigma公司;兔血無(wú)菌采自健康家兔;藥敏試紙(批號(hào)：090801)及微量生化反應(yīng)管(批號(hào)：20090714)購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。2×Taq PCR Master Mix、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、凝膠回收試劑盒等購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。健康昆明小白鼠購(gòu)于四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 ,共60只 ,規(guī)格 19～21g/只。

引物采用擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA的通用引物[5],上、下游引物序列分別為：5′-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3′和 5′-ACGGCTACCT TGTTACGAC T T-3′。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

無(wú)菌條件下分別用接種環(huán)醮取肝、肺和腸道內(nèi)部分別接種LB固體和液體培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基,37℃恒溫箱培養(yǎng)18～24h,同時(shí)進(jìn)行厭氧培養(yǎng),對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行純化培養(yǎng),挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,用5%的兔鮮血平板鑒定溶血性。

將分離純化的細(xì)菌接種于細(xì)菌理化特性鑒定用培養(yǎng)基中,進(jìn)行氧化酶、接觸酶、吲哚、糖(醇及苷)類代謝等較系統(tǒng)的理化特性測(cè)定,具體方法參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[6]。

將分離到的細(xì)菌純化后,參照文獻(xiàn)[7]中試驗(yàn)規(guī)范進(jìn)行藥敏試驗(yàn),并對(duì)照杭州微生物試劑有限公司的藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判定結(jié)果。

在培養(yǎng)平板上無(wú)菌挑取單個(gè)菌落直接加入到反應(yīng)體系中進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系(50μ L)：2×Taq PCR Master Mix 20μ L,引物各 1.5μ L,超純水 27μ L;反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 10min,95℃循環(huán)變性30s,53℃退火復(fù)性30s,72℃延伸1min30s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán),72℃終延伸 8min,最后4℃保存,反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,用瓊脂凝膠回收試劑盒將PCR產(chǎn)物回收后,送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,用菌落計(jì)數(shù)法調(diào)整菌懸液濃度至 3.6×109、3.6×108、3.6×107、3.6×106、3.6×105CFU/mL共5個(gè)稀釋度;采用無(wú)菌操作技術(shù),以0.2mL/只的劑量對(duì)小白鼠進(jìn)行腹腔注射,對(duì)照組以0.2mL/只的劑量腹腔注射無(wú)菌生理鹽水,每組5只,健康小白鼠暫養(yǎng)3d觀察健康后進(jìn)行致病性試驗(yàn);在接種后每隔6h觀察一次,連續(xù)觀察14d,記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臨床表現(xiàn),對(duì)死亡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行剖解,觀察并記錄各組織器官的病變;從死亡小白鼠肺臟和腸道中再次分離細(xì)菌,并進(jìn)行鑒定;依改良寇氏法求出半致死劑量(LD50)[8]。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離鏡檢 剖檢的病鼠肺和腸道中均有大量細(xì)菌,經(jīng)分離純化后獲得一株優(yōu)勢(shì)菌。該菌株生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)要求不高,兼性厭氧,在LB固體培養(yǎng)基形成灰白色黏液狀圓形大菌落,用接種環(huán)挑之有絲狀;麥康凱培養(yǎng)基上長(zhǎng)成紅色菌落;兔血平板上無(wú)溶血現(xiàn)象。革蘭氏染色鏡檢,該菌為短粗、卵圓形G-桿菌,有莢膜,單個(gè)或雙個(gè)存在。

2.2 生化鑒定 該菌為兼性厭氧發(fā)酵型無(wú)運(yùn)動(dòng)能力的G-桿菌,其理化特性見(jiàn)表1。

2.3 藥敏試驗(yàn) 表2為藥敏試驗(yàn)結(jié)果,該菌對(duì)供試的頭孢美唑等藥物高度敏感,對(duì)丁胺卡那霉素等藥物中度敏感,對(duì)潔霉素等藥物耐藥。

表1 分離菌的生理生化特征Table 1 Biochemical and physiological characteristics of the strain

2.4 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 將該株菌進(jìn)行純化培養(yǎng)后,挑取少量單個(gè)菌落進(jìn)行16SrDNA-PCR擴(kuò)增(50μ L體系),其產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳后結(jié)果如圖1所示,該菌株擴(kuò)增出的16SrDNA的片斷大小約1 500bp。測(cè)序后經(jīng)BLAST分析測(cè)序結(jié)果表明：該菌株16SrDNA基因部分序列與肺炎克雷伯氏菌(GenBank中的序列注冊(cè)號(hào)：GU339298)的同源性最高,達(dá)99%。

2.5 致病性檢測(cè) 該菌株對(duì)小白鼠的致病性結(jié)果見(jiàn)表3。發(fā)病小白鼠出現(xiàn)呼吸困難、腹腔有膠胨樣積液,腸道嚴(yán)重臌氣,肺臟有實(shí)變和充血,腎臟有出血點(diǎn)等癥狀,與自然發(fā)病竹鼠癥狀一致;對(duì)照組正常。從死亡小鼠肺臟中再次分離到的菌株經(jīng)鑒定與試驗(yàn)菌株一致。該菌株對(duì)小白鼠的LD50為4.5×107CFU/只。

圖1 16S rDNA-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplif ication of 16S rDNA

3 討 論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)發(fā)病竹鼠進(jìn)行細(xì)菌分離,根據(jù)培養(yǎng)特性、理化特征和16SrDNA序列分析,判定分離得到的菌株為肺炎克雷伯氏菌。參照相關(guān)文獻(xiàn)[9-12],選擇其敏感實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小白鼠對(duì)分離菌株進(jìn)行致病性試驗(yàn),確定分離得到菌株為此次竹鼠發(fā)病的主要病原菌。該菌能引起竹鼠肺炎、腹膜炎和腸道臌氣等癥狀,其 LD50為4.5×107CFU/只。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity test of the strain

肺炎克雷伯氏菌分布廣泛,最先從大葉性肺炎病人的肺組織中分離到,當(dāng)機(jī)體免疫力降低或長(zhǎng)期服用抗生素導(dǎo)致菌群失調(diào)時(shí)易引起感染,若治療不當(dāng)則死亡率極高。目前,在人類感染中肺炎克雷伯氏菌是除大腸桿菌外的醫(yī)源性感染最重要條件致病菌;在動(dòng)物感染中各種家畜家禽、野生動(dòng)物及水生動(dòng)物都可感染[3,13],并且是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中常被檢出的病原菌[14-15],其已成為倍受關(guān)注的人獸共患病病原。到目前為止,還沒(méi)有從竹鼠病變組織中分離到該致病菌的報(bào)道。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,此次得到的該株肺炎克雷伯氏菌對(duì)頭孢美唑等高度敏感,對(duì)丁胺卡那霉素等中度敏感,對(duì)潔霉素等耐藥。建議臨床上選用高敏藥物或中敏藥物加大劑量進(jìn)行治療用,避免濫用抗生素而引起的病原菌對(duì)大量藥物產(chǎn)生耐藥性。廣譜抗菌素的大量使用導(dǎo)致機(jī)體正常菌群的失調(diào),會(huì)增加肺炎克雷伯氏菌的易感性,故要慎重用藥。據(jù)相關(guān)資料顯示,各種降低免疫功能的慢性病、腎上腺皮質(zhì)激素和其他免疫抑制劑的應(yīng)用和某些創(chuàng)傷性診療技術(shù)也會(huì)增加肺炎克雷伯氏菌的易感性,是生產(chǎn)過(guò)程中不能忽視的問(wèn)題。本次試驗(yàn)為竹鼠健康養(yǎng)殖生產(chǎn)和對(duì)預(yù)防肺炎克雷伯氏菌病提供一定的參考價(jià)值。

表3 菌株對(duì)小白鼠的致病性(死亡數(shù)/試驗(yàn)數(shù))Table 3 Pathogenicity of the strain to mouse(Death no./test no.)

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