谷文喜,袁 潔,陳 晶,顏 瑾,鄧小玲,柯昌文,何劍鋒

2.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,廣州 510080;

3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所,廣州 510640

狂犬病是由狂犬病病毒引起的急性致死性人獸共患傳染病,主要侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng),造成受害動(dòng)物極度興奮、狂躁不安和意識(shí)障礙,一旦發(fā)病,病死率100%。我國(guó)是世界上狂犬病第二嚴(yán)重國(guó)家,疫情主要集中在南方各省,廣東省是我國(guó)狂犬病高發(fā)省之一,犬是廣東省狂犬病的主要傳播動(dòng)物。調(diào)查發(fā)現(xiàn),在發(fā)病者中有 81.51%～95.7%的感染都來(lái)自犬[1-6],說(shuō)明在狂犬病的流行中,犬在其中起著重要的作用。為了了解健康犬對(duì)人潛在的威脅程度,我們對(duì)廣東省境內(nèi)外表健康犬的狂犬病毒帶毒率進(jìn)行了調(diào)查。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 標(biāo)本的采集 于2008年在廣東省境內(nèi)隨機(jī)抽取10個(gè)地市,對(duì)待銷(xiāo)售的食用犬及流浪犬進(jìn)行犬腦(海馬回、小腦、中腦和大腦)的采集,標(biāo)本冷鏈送往廣東省CDC檢測(cè)。

1.2 方法 用WHO推薦的狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷方法直接免疫熒光法(DFA)對(duì)所有犬腦組織樣品進(jìn)行狂犬病病毒抗原篩查檢測(cè),陽(yáng)性樣品再用巢氏聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和小鼠感染法(MIT)進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)。陽(yáng)性RT-PCR產(chǎn)物純化(QIA quick PCR Purification Kit)后,直接進(jìn)行測(cè)序并和部分已發(fā)表狂犬病病毒序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.1 DFA檢測(cè)犬腦組織中病毒抗原

1.2.1.1 制備腦組織印片 取大腦、中腦和小腦3個(gè)部分的橫斷面,均勻涂印于酒精處理過(guò)的干燥載玻片上,室溫干燥后,冷丙酮(-20℃)固定過(guò)夜。

1.2.1.2 熒光染色 固定好的載玻片取出吹干,將稀釋好的狂犬病毒熒光抗體(Rabies IFA Reagent,美國(guó)Chemicon公司)滴加在腦組織印跡上(確保完全覆蓋),然后放入濕盒中,37℃,30min,用緩流沖洗抗原片15s,再用PBS振洗2遍,浸泡1遍,吹干,90%甘油(PBS)封片。

1.2.1.3 熒光顯微鏡觀察 仔細(xì)觀察每個(gè)視野的熒光強(qiáng)度,結(jié)合其分布狀況進(jìn)行判定。以觀察到特異性翠綠色點(diǎn)狀熒光判為陽(yáng)性,否則為陰性。

1.2.2 RT-PCR法檢測(cè)DFA陽(yáng)性及可疑陽(yáng)性樣本中的病毒核酸 對(duì)DFA初檢中的陽(yáng)性和可疑陽(yáng)性樣本進(jìn)行狂犬病毒特異性核蛋白基因(N)片段的檢測(cè),引物序列及相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物及相關(guān)信息Table 1 Primers sequences used for the PCR

1.2.2.1 標(biāo)本RNA的提取 取DFA陽(yáng)性犬的不同部位腦組織共約100 mg,加入200 μ L Trizol(美國(guó) Invitrogen公司),研磨機(jī)研磨均勻,補(bǔ)Trizol加至1 000 μ L,快速顛倒離心管30～40次充分混勻內(nèi)容物,室溫放置5 min;加 200 μ L氯仿,快速顛倒離心管數(shù)次(30 s),使其呈淡粉紅色,室溫放置3 min;4℃離心,12 000 r/min,15 min;取離心后水相600 μ L,加入到已有 600 μ L異丙醇的新的離心管中,輕柔混勻。室溫放置10 min;4℃離心,12 000 r/min,10 min;緩緩倒掉上清,用槍頭輕輕吸去殘存液體,可見(jiàn)少量沉淀;加1 mL 75%乙醇(DEPC H2O新鮮配制)洗滌沉淀;4℃離心,12 000 r/min,10 min;緩緩倒掉上清,用槍頭輕輕吸去殘存液體,室溫干燥數(shù)分鐘;沉淀溶于70 μ L DEPC水中,分裝于2個(gè)離心管中,直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄或-70℃儲(chǔ)存。

1.2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA Pd(N)6稀釋至0.2 μ g/μ L。水浴預(yù)熱至65 ℃,33 μ L RNA 液 65 ℃水浴 10 min,冰浴 2 min,瞬時(shí)離心 ;將 32 μ L RNA 液轉(zhuǎn)移至逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管(Ready-To-GO You-Prime First-Strand Beads,美國(guó)Amersham 公司)中,加入1 μ L隨機(jī)引物Pd(N)6(Takara公司),使總體積達(dá)到 33 μ L;室溫放置1 min,混勻,瞬時(shí)離心;37 ℃水浴,60 min,得到cDNA,-20℃或-70℃保存。

1.2.2.3 RT-PCR 將上游引物N127,下游引物N829和cDNA加入Go Taq Green Mix(美國(guó)Promega公司)中,進(jìn)行第一次 PCR循環(huán),條件為：94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,56℃退火30s,72℃延伸40 s,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。以第1次反應(yīng)產(chǎn)物作為模板,并加入上游引物N371F和下游引物N371R,進(jìn)行第二次PCR反應(yīng),反應(yīng)條件與第一次反應(yīng)條件相同。以DL2000(Takara公司)為Marker,在2%瓊脂糖凝膠上電泳,觀察結(jié)果。

1.2.3 MIT試驗(yàn) 采用RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性犬的腦組織2份,分別加緩沖鹽水研磨,制成20%的懸液,腦內(nèi)10 μ L接種5只乳鼠,接種后繼續(xù)由母鼠喂養(yǎng),每天觀察發(fā)病情況,在9～17d內(nèi)出現(xiàn)震顫、麻痹或死亡者,取出腦組織,做 DFA和 RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證。

1.2.4 核酸測(cè)序 PCR陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物用Qiagen公司膠回收試劑盒純化,用PCR引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)并純化產(chǎn)物,再用ABI PRISM○R3130測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果的比對(duì)及基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建均使用MEGA 4軟件包以鄰位相連法(NJ)完成。所用參考毒株N基因序列來(lái)源于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),具體信息見(jiàn)表2。

2 結(jié) 果

所有1 833份腦組織樣本先用DFA法進(jìn)行初篩,共檢出陽(yáng)性和可疑陽(yáng)性樣本325份,陽(yáng)性率為17.73%。對(duì)這325份腦組織陽(yáng)性或可疑樣本進(jìn)行RT-PCR法檢測(cè),得到陽(yáng)性結(jié)果2份,占 1 833份的0.11%。把這2份陽(yáng)性樣品分別用MIT法再次檢驗(yàn),結(jié)果都為狂犬病病毒陽(yáng)性。

2.1 DFA法檢測(cè)結(jié)果 共有325份標(biāo)本腦印片觀察到翠綠色點(diǎn)狀熒光?？袢〔《究乖?yáng)性和陰性照片見(jiàn)圖1。

2.2 RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果 對(duì)325份DFA陽(yáng)性樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),有2份樣本電泳顯示得到與目的片段(371bp)大小一致的條帶,其它樣本均無(wú)條帶,見(jiàn)圖 2。

表2 廣東省分離狂犬病毒毒株與參考毒株相關(guān)信息Table 2 Information of viruses'gene used in this study

圖1 DFA法檢測(cè)狂犬病病毒抗原照片F(xiàn)ig.1 The picture of rabies antigen by DFA：positive(left),negative(right)

2.3 MIT法檢測(cè)結(jié)果 發(fā)病及死亡鼠腦組織做DFA檢測(cè),鏡檢觀察到典型的翠綠色尼基氏小體,且RT-PCR電泳也出現(xiàn)了371 bp的目的大小條帶,可以證明確實(shí)是狂犬病毒感染。

2.4 核蛋白基因(N)片段序列分析 對(duì)廣東分離株與參考毒株的N基因片段做進(jìn)一步測(cè)序分析,結(jié)果顯示廣東分離的2個(gè)毒株都屬于狂犬病毒I型,與其它部分已發(fā)表毒株基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)關(guān)系如圖3,廣東分離株GD1和GD2同源性為99.8%;與湖南株GX01同源性最高分別為99.4%和99.3%;在四個(gè)疫苗株中,廣東分離株與CTN株的同源性最高分別為94.6%和94.5%,與印度、印度尼西亞和泰國(guó)分離株比較,與泰國(guó)分離株同源性最高為88.5%～89%。

3 討 論

近幾年狂犬病在我國(guó)呈高發(fā)態(tài)勢(shì)。由于犬與人類(lèi)的接觸最為密切,且犬仍然是狂犬病流行的重要宿主動(dòng)物和傳染源[7],因此掌握外觀健康犬的帶毒情況對(duì)狂犬病的防控有著重要意義。通過(guò)序列分析顯示廣東分離到的兩毒株同源性在99.8%,表明它們有著共同的來(lái)源;廣東株與湖南株HuNPN01、廣西株GX01處于同一分支中,親緣關(guān)系最近,考慮到三省互臨,我們推測(cè)該類(lèi)狂犬病毒在三省間可能呈循環(huán)傳播。值得注意的是,雖然湖南株HuNPN01分離自豬,但流行病學(xué)資料顯示,此次豬群間爆發(fā)的狂犬病是由豬場(chǎng)主鄰居家一條發(fā)病犬竄入豬場(chǎng)咬傷豬只而引起的[8],這至少說(shuō)明此型病毒依然主要是在犬中流行;在我國(guó)目前使用的 4個(gè)疫苗株中,CTN與廣東毒株親緣關(guān)系最近,提示在病毒分離地區(qū)使用CTN株疫苗對(duì)犬只進(jìn)行免疫應(yīng)能取得較好的保護(hù)效果;與東南亞三個(gè)鄰國(guó)毒株序列的比較,發(fā)現(xiàn)廣東株與泰國(guó)株和印度尼西亞株的同源性最為接近,預(yù)示三地間狂犬病毒有一定的聯(lián)系,需要做更深入的流行病學(xué)研究。

直接熒光抗體法(DFA)是WHO推薦的實(shí)驗(yàn)室診斷方法,也是我國(guó)狂犬病診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS281-2007)中指定的狂犬病病毒抗原檢測(cè)方法之一。我國(guó)狂犬病診斷標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,臨床確診病例加上以下的任何一項(xiàng),即DFA或ELISA檢測(cè)狂犬病病毒陽(yáng)性、RT-PCR檢測(cè)狂犬病病毒核酸陽(yáng)性或細(xì)胞培養(yǎng)分離到狂犬病病毒,就可以做為實(shí)驗(yàn)室確診病例。本研究中由于檢測(cè)的是外觀健康犬(非發(fā)病犬),因此使用了DFA和RT-PCR兩種方法結(jié)合進(jìn)行檢測(cè),其優(yōu)點(diǎn)是DFA法成本低、操作簡(jiǎn)便、快速,便于進(jìn)行批量篩查檢測(cè),RT-PCR法敏感、準(zhǔn)確、結(jié)果客觀。本研究1 833份樣本中DFA檢測(cè)陽(yáng)性325份,陽(yáng)性率為17.73%,這一結(jié)果與此前報(bào)道廣東省外觀健康犬的帶毒率為17.7%[9]一致。而后對(duì)這325份DFA陽(yáng)性樣本進(jìn)行RT-PCR法檢測(cè),陽(yáng)性結(jié)果2份,計(jì)算得出總體陽(yáng)性率為0.11%。兩種檢測(cè)方法的結(jié)果差異非常大,造成這種DFA方法檢測(cè)陽(yáng)性率過(guò)高現(xiàn)象的原因可能是：此前報(bào)道的帶毒率為17.7%的研究方法與本研究中的DFA法原理相似,都是利用免疫熒光原理對(duì)狂犬病病毒抗原進(jìn)行檢測(cè),但是在制片過(guò)程中如果印片過(guò)厚或沖洗不徹底易發(fā)生熒光染料非特異性堆積,進(jìn)而造成假陽(yáng)性結(jié)果[10];由于是對(duì)非發(fā)病犬樣本進(jìn)行檢測(cè),即使樣本含有病毒顆粒也可能數(shù)量較少,這在結(jié)果判定上不易區(qū)分非特異殘存熒光顆粒和這種弱陽(yáng)性熒光顆粒之間的差異,往往容易把少量存在的非特異殘存熒光顆粒判定為弱陽(yáng)性;就DFA方法本身而言,對(duì)于可疑陽(yáng)性樣本的判定,觀察者主觀因素的影響是很大的,有報(bào)道在同一實(shí)驗(yàn)室由于操作者和試劑不同,其前后兩次的DFA結(jié)果也不同[11]?；谝陨显?對(duì)DFA可疑陽(yáng)性樣本有必要再用 RT-PCR法進(jìn)行復(fù)核檢測(cè),最終應(yīng)以?xún)煞N方法都為陽(yáng)性者判為陽(yáng)性結(jié)果,這種組合檢測(cè)方法已被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室用于組織樣本中狂犬病毒抗原的檢測(cè)[12-15]。而本研究中使用的RVN371巢式PCR法擴(kuò)增的特異性N基因片段具有很高的特異性,其序列通過(guò)分析能夠反映出不同毒株間的遺傳衍化關(guān)系[16-18],可對(duì)狂犬病毒的核酸進(jìn)行有效檢測(cè)。

廣東省是我國(guó)狂犬病發(fā)病最嚴(yán)重的省份之一,防控狂犬病刻不容緩。除了要繼續(xù)加大對(duì)狂犬病的預(yù)防控制和宣傳力度外,也要加強(qiáng)對(duì)狂犬病的監(jiān)測(cè)能力,要讓狂犬病的監(jiān)測(cè)做到常態(tài)化,及時(shí)掌握廣東省內(nèi)及周邊省份乃至鄰國(guó)的狂犬病流行動(dòng)態(tài),為可能爆發(fā)的疫情做好準(zhǔn)備。

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