馮艷青 劉泉

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，發(fā)病過程涉及淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞以及多種細(xì)胞因子，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。但其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，有研究發(fā)現(xiàn)，CD+4T細(xì)胞(Th)兩種亞型Th1、Th2功能失衡在哮喘發(fā)病過程中占據(jù)重要地位［1］。為探討哮喘的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在大鼠出生早期于鼻咽部給予不同濃度的滅活肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌混合液，大鼠飼養(yǎng)至成年后造模，檢測動物血清中白介素-4(IL-4)、干擾素-γ(IFN-γ)的水平。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物 健康SD孕鼠4只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供);體重240～270 g，8周齡，動物使用許可證號:SCXK(京):2006-0005，所產(chǎn)幼鼠供實(shí)驗(yàn)用。

1．2 試劑與儀器 卵蛋白(OVA，Sigma公司);百日咳桿菌菌苗(4．7×1010/ml，北京生物制品研究所);肺炎鏈球菌［23F型，昌平疾病預(yù)防控制中心(CDC)傳染病所］;流感嗜血桿菌(乙型，昌平CDC傳染病所);超聲霧化器(德國百瑞公司);IL-4試劑盒(尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)、IFN-γ試劑盒(尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司);自制霧化吸入箱(30 cm×40 cm×50 cm)。

1．3 方法

1．3．1 細(xì)菌滅活:將菌種進(jìn)行傳代及培養(yǎng)后，用VITEK比濁儀測定細(xì)菌濃度，用終濃度為0．5% ～1%的甲醛溶液滅菌，涂碟確定無活菌后置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．2 出生后細(xì)菌抗原接種:幼鼠40只，不分雌雄，隨機(jī)分為5 組:即107、106、105細(xì)菌抗原組(A，B，C 組)、哮喘組(D 組)、對照組(E組)，每組8只。細(xì)菌抗原組大鼠于出生后第1、3、5、7天分別于鼻咽部給予107、106、105滅活肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌混合液10 μl，哮喘組和對照組則給予 PBS 10 μl。

1．3．3 哮喘模型制備:大鼠飼養(yǎng)至成年(約6 周齡)，A、B、C、D組大鼠分別于雙側(cè)鼠蹊部皮下注射卵蛋白(OVA)(Ggrade V)和氫氧化鋁凝膠混懸液共1 ml(含 OVA 1 mg和氫氧化鋁50 mg)，同時腹腔注射百日咳桿菌菌苗(5×109/ml)1 ml致敏，2周后，將大鼠置于自制半透明霧化吸入箱中，用2%OVA(GradeⅡ)霧化吸入激發(fā)，30 min/次，連續(xù) 7 d，30 min/組大鼠則于雙側(cè)鼠蹊部皮下注射氫氧化鋁凝膠混懸液1氫氧化鋁50 mg)，同時腹腔注射0．9%氯化鈉溶液1 ml致敏，2周后，使用0．9%氯化鈉溶液霧化吸入激發(fā)。最后一次激發(fā)24 h內(nèi)采集標(biāo)本。腹主動脈取血，分離血清，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．4 血清 IL-4 和 IFN-γ 測定:采用 ELISA 法，IL-4、IFN-γ 的檢測按試劑盒說明進(jìn)行。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析方法，組間兩兩比較方差齊時采用方差分析最小顯著法，如方差不齊，則采用近似方差分析Tamhane’s T2方法，P ＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

A、B組大鼠血清中IFN-γ水平與D、E組比較明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)。見表1。

表15組大鼠血清IL-4和IFN-γ水平比較n=8，±s

表15組大鼠血清IL-4和IFN-γ水平比較n=8，±s

注:與 A 組比較，*P ＜0．01，#P ＜0．01;與 B 組比較，△P ＜0．05，☆P ＜0．01;與 C 組比較，▲P ＜0．05

組別 IL-4(pg/ml) IFN-γ(pg/ml)A組(n=8)26 ±20 11．9 ±2．7 B 組(n=8) 24±4 13．6±4．0 C 組(n=8) 27±11 20．5±4．3 D 組(n=8) 26±9 24．2±8．4＊△E 組(n=8) 20±7 30．6±9．0#☆▲

3 討論

支氣管哮喘是世界范圍內(nèi)的常見病，影響著全球約3億人的健康［1］，發(fā)病率呈逐年上升趨勢［2］。關(guān)于哮喘發(fā)病內(nèi)在機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，CD+4T細(xì)胞(Th)兩種亞型輔助性T淋巴細(xì)胞1(Th1)、輔助性T淋巴細(xì)胞2(Th2)功能失衡是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制［3，4］。IFN-γ 和 IL-4分別是 Th1和 Th2細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子，通過檢測這兩種細(xì)胞因子可以了解Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的功能狀態(tài)［5］。駱文玲等［6］給新生SD大鼠皮下注射OVA，大鼠成年后檢測其血清中IFN-γ和IL-4，發(fā)現(xiàn)哮喘組大鼠血清中IL-4明顯高于正常對照組，而IFN-γ則顯著下降。李光等［7］給Wistar大鼠腹腔注射OVA，激發(fā)后檢測哮喘組動物脾單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4水平明顯高于正常對照組，而IFN-γ則顯著實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，D組大鼠血清而IFN-γ下降，存在Th2 h1/Th2失衡;早期接觸細(xì)菌抗原的大鼠，血清IFN-γ水平明顯下降，而 IL-4與 D組接近，使 Th1/Th2失衡更為明顯［8］。

1 李明華，殷凱生，蔡映云主編．哮喘病學(xué)．第2版．北京:人民衛(wèi)生出版社，2005．33-566．

2 Bonini S．The hygiene hypothesis:epidemiologic evidence．J Pediatr Gastroenterol Nutr，2005，40(suppl 1):37-38．

3 拉杰．哮喘發(fā)病機(jī)理及Th1/Th2比例的關(guān)系．天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002，8:403-406．

4 Renz H，Blumer N，Virnas S，et al．The immunological basis of the hygiene hypothesis．Chem Immunol Allergy，2006，91:30-48．

5 Fang SP，Tanaka T，Tago F，et al．Immunomodulatory effects of gyokuheifusan on IFN-gamma/Il-4(Th1/Th2)balance in ovalbumin(OVA)-induced asthma model mice．Biol Pharm Bull，2005，28:829-833．

6 駱文玲，李海潮，郝洪軍，等．早期接觸過敏原對大鼠哮喘模型的影響．北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2006，38:159-163．

7 李光，趙育瑩，曲書強(qiáng)，等．支氣管哮喘模型大鼠IL-4 IL-10 IFN-γ的檢測．中國當(dāng)代兒科雜志，2004，6:474-476．

8 孟文霞，劉艷梅，李曉鸞，等．不同變應(yīng)對上下氣道變應(yīng)性疾病的影響．河北醫(yī)藥，2010，32:824-825．