邢丹，王文全*，于福來，李衛(wèi)東，王文杰

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102；3.華宏康中藥材種植有限公司，北京 101300）

栽培

知母種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法研究△

邢丹1，2，王文全1，2*，于福來1，李衛(wèi)東1，2，王文杰3

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102；3.華宏康中藥材種植有限公司，北京 101300）

目的：制定知母種子檢驗(yàn)方法，為知母種子檢驗(yàn)規(guī)程及質(zhì)量分級的制定奠定基礎(chǔ)。方法：參照中國農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程對知母種子的扦樣、凈度分析、真實(shí)性鑒定、千粒重、含水量、發(fā)芽率、生活力等指標(biāo)進(jìn)行了測定。結(jié)果與結(jié)論：通過對知母種子7項(xiàng)指標(biāo)的測定，初步建立了知母種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法。

知母；種子；質(zhì)量檢驗(yàn)

知母是我國傳統(tǒng)的大宗藥材，為百合科知母屬植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖。其味苦、甘，性寒，具有清熱瀉火，滋陰潤燥的功能［1］。知母原為野生，現(xiàn)已有大面積栽培品種。中藥材質(zhì)量受多方面因素的影響，其中種子是中藥材生產(chǎn)的源頭［2］，而目前包括知母在內(nèi)的絕大部分中藥材種子尚未建立起相應(yīng)的種子檢驗(yàn)方法，無法對其質(zhì)量進(jìn)行有效控制，造成了市場上的種子質(zhì)量良莠不齊［3］。因此開展種子質(zhì)量檢驗(yàn)研究，制定種子檢驗(yàn)規(guī)程，是國家推進(jìn)中藥材規(guī)范化生產(chǎn)工作的一項(xiàng)任務(wù)［4］。本實(shí)驗(yàn)通過對知母種子凈度、千粒重、含水量、發(fā)芽率、生活力等主要指標(biāo)的研究，初步制定了知母種子的檢驗(yàn)方法，為知母種子質(zhì)量檢驗(yàn)規(guī)程的制定及種子質(zhì)量分級奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

知母種子于2009年9月購自河北安國和易縣，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王文全教授鑒定為百合科知母屬植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的種子。

1.2 儀器設(shè)備

LRH-150-G型光照培養(yǎng)箱，CX-21型顯微鏡，BP211D十萬分之一電子天平，恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

2 方法

2.1 扦樣

按照GB/T3543.2—— “農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程”扦樣執(zhí)行［5］。

2.2 凈度分析

按GB/T3543.3—— “農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程”凈度分析執(zhí)行［5］。在不損傷發(fā)芽率的基礎(chǔ)上進(jìn)行檢查，直接挑選純凈種子。

2.3 種子性狀鑒定

本實(shí)驗(yàn)采用種子外觀形態(tài)法，從供試樣品中隨機(jī)數(shù)取100粒凈種子，4次重復(fù)，在顯微鏡下逐粒觀察種子形態(tài)特征，并測量其長度、寬度。

2.4 重量測定

本試驗(yàn)分別考察百粒法、五百粒法及千粒法。具體方法如下：隨機(jī)數(shù)取100，500，1 000粒知母種子，用電子天平稱重，并分別重復(fù)8次、3次和2次，記錄其重量。

2.5 含水量測定

參照GB/T 3543.6—— “農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程”水分測定執(zhí)行［5］。本實(shí)驗(yàn)分別采用高恒溫烘干法和低恒溫烘干法對種子含水量進(jìn)行測定。（1）高恒溫烘干法：分別在（133±2）℃高溫條件下，設(shè)置1，2，3，4，5h對種子水分損失量進(jìn)行測定；（2）低恒溫烘干法：分別在（105±2）℃低恒溫條件下，設(shè)置5，10，15，20，25h計(jì)算種子水分損失量。以上試驗(yàn)每份處理重復(fù)4次，每次稱重（4.5±0.001）g。

2.6 發(fā)芽率測定

2.6.1 發(fā)芽床的確定 發(fā)芽床實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個處理，分別以紙上、紗布和蛭石為發(fā)芽床，每處理重復(fù)4次，每重復(fù)50粒種子。

2.6.2 發(fā)芽溫度的確定 分別考察20，25，30℃ 3個處理，每處理重復(fù)4次，每重復(fù)50粒種子，放入光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)。

2.6.3 發(fā)芽計(jì)數(shù)時間的確定 在適宜種子發(fā)芽的條件下，確定初次和末次計(jì)數(shù)時間。以種子胚根伸出種皮2mm時為初次計(jì)數(shù)時間，以種子萌發(fā)達(dá)到最高且以后再無萌發(fā)種子出現(xiàn)時的天數(shù)為末次計(jì)數(shù)時間。

2.7 生活力測定

隨機(jī)抽取一定量的凈種子，室溫下在清水中浸泡12 h，利用解剖刀將種子縱切使之一分為二，使種子胚完全露出。本實(shí)驗(yàn)采用3因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34），四唑染色時間設(shè)1，3，5 h，濃度設(shè)0.2%，0.4%，0.6%，溫度設(shè)25，30，35℃。每個處理400粒種子，4次重復(fù)，每次重復(fù)100粒種子。染色結(jié)束后，瀝去溶液，用清水沖洗，將種仁擺在培養(yǎng)皿中，逐一檢查。

3 結(jié)果與分析

3.1 扦樣

種子批的最大重量為1 000 kg，送檢樣品最少量為250 g，凈度分析試樣最少量為25 g。

3.2 凈度分析

3份知母種子試樣中無其他植物種子，所以本次檢驗(yàn)不用記錄這一項(xiàng)。根據(jù)2.2中所述方法做凈度分析，各試樣增失差距均沒有偏離原始質(zhì)量的5%，如表1所示，所以此方法切實(shí)可行。

表1 不同產(chǎn)地知母種子凈度測定

3.3 種子性狀鑒定

鑒別依據(jù)如下：在顯微鏡下觀察其種子，蒴果長卵形，成熟時上方開裂，長7.5～12.0 mm，寬2.1～4.2 mm，表面黑色，有細(xì)瘤狀突起，具3～4翅狀棱，背部呈弓狀隆起，腹棱平直，下端有一微凹的種臍。胚呈白色，稍彎曲。

3.4 千粒重測定

知母種子重量測定結(jié)果見表2。由表2可知，百粒法各處理間變異系數(shù)均小于4.0%，500粒法各處理間的變異系數(shù)均高于百粒法，千粒法測定變異系數(shù)最小，平均為1.191。綜合比較3種方法，3種方法間無顯著性差異（P＞0.05），見表3。但從準(zhǔn)確性角度來考慮，百粒法作為知母種子千粒重的測定方法更為合適。

表2 知母種子重量測定結(jié)果

表3 不同產(chǎn)地知母種子千粒重比較

3.5 含水量測定

知母種子在高溫下烘干4～5 h后，失水量基本保持穩(wěn)定，且在5～6 h內(nèi)無顯著變化，綜合兩產(chǎn)地種子情況，高恒溫烘干法選擇5 h為宜；在低恒溫烘干15 h后失水量變化不明顯，且在15～20 h內(nèi)失水量變化不明顯，綜合兩產(chǎn)地種子情況，低恒溫烘干法應(yīng)選擇的烘干時間以15 h為宜，見表4。

在對高溫烘干5 h和低溫烘干15 h兩種方法進(jìn)行比較時發(fā)現(xiàn)，兩種烘干方法測定值差異不顯著（P＞0.05），見表5。鑒于低恒溫烘干法所需時間較長，因此選擇高恒溫烘干5 h為知母種子含水量測定方法。

3.6 發(fā)芽率測定

3.6.1 發(fā)芽前的處理 將知母凈種子放于清水中浸泡12 h，以0.2%高錳酸鉀溶液消毒20 min后用清水沖洗干凈。

表4 不同烘干方法知母種子失水量變化

表5 不同烘干方法間種子含水量比較

3.6.2 發(fā)芽溫度的確定 在以濾紙為發(fā)芽床的條件下，設(shè)20，25，30℃ 3種溫度，試驗(yàn)結(jié)果見表6，其中在25℃下種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均高于20℃和30℃的指標(biāo)，因此選擇25℃為知母種子的發(fā)芽溫度。

表6 不同溫度條件下知母種子發(fā)芽情況比較

3.6.3 發(fā)芽床的確定 在25℃溫度下，設(shè)濾紙、紗布和蛭石3種發(fā)芽床，試驗(yàn)結(jié)果如表7所示，其中以濾紙為發(fā)芽床的種子，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均高于其他兩種發(fā)芽床的指標(biāo)，因此選擇濾紙作為知母種子發(fā)芽床。

表7 不同發(fā)芽床條件下知母種子發(fā)芽情況比較

3.7 生活力測定

3.7.1 知母種子生活力測定條件的確定 本試驗(yàn)采用3因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34）。四唑染色時間設(shè)1，3，5 h，濃度設(shè)0.2%，0.4%，0.6%，培養(yǎng)溫度設(shè)25，30，35℃，結(jié)果如表8所示，染色時間5 h、四唑濃度0.6%、溫度30℃是知母種子生活力檢測的適宜條件。

表8 四唑不同處理對知母種子生活力檢測的影響

3.7.2 染色鑒定標(biāo)準(zhǔn)的建立 有生活力種子的染色情況：（1）胚和胚乳完全著色，呈紅色。無生活力的種子染色情況：（1）著色淺，呈粉色；（2）胚和胚乳完全不著色。

4 討論

知母種子生活力快速檢測時，也曾應(yīng)用溴麝香草酚蘭（BTB）法，但BTB瓊脂制作麻煩、冷凝時間快，且染色與否不易被觀察，不能準(zhǔn)確反映種子的生活力狀況，因此知母種子生活力檢測選擇了四唑染色法。但利用四唑染色法也有一定的不足，種子染色深淺程度較為相似，對其生活力的測定可能會造成一定的誤差。

目前農(nóng)作物種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法比較成熟，但絕大部分中藥材種子還沒有相應(yīng)的國家檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，也無法對市場上的中藥材種子質(zhì)量進(jìn)行有效控制。因此，開展中藥材種子檢驗(yàn)規(guī)程和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，是我國中藥材規(guī)范化生產(chǎn)急需解決的重要問題［6］，但目前我國尚不具備全面開展健康檢驗(yàn)的條件，且大多數(shù)中藥材來源混亂，這也對種子檢驗(yàn)方面造成了一定的影響。

［1］國家藥典委員會.中國藥典［S］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：197-198.

［2］陳秀華，魏勝利，王文全.種質(zhì)資源與中藥材質(zhì)量［J］.中藥研究與信息，2003，5（4）：11-14.

［3］賀玉林，李先恩，淡紅梅，等.遠(yuǎn)志種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.種子，2007，26（1）：106-107.

［4］任德權(quán)，周榮漢.中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP）實(shí)施指南［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：26.

［5］全國農(nóng)作物種子標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會，全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心.GB/T3543.2《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》實(shí)施指南［S］.

［6］郭巧生，張賢秀，王艷茹，等.夏枯草種子品質(zhì)檢驗(yàn)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)初步研究［J］.中國中藥雜志，2009，34（7）：815.

Testing Methods of Seed Quality for Anemarrhena Asphodeloides

XING Dan1，2，WANGWen-quan1，2，YU Fu-lai1，LIWei-dong1，2，WANGWen-jie3
（1.Chinese Pharmacy College，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China；2.The Engineering Research Center for Chinese Medicine Standardized Production of Educational Ministry，Beijing 100102，China；3.Beijing Hua-Hong-Kang Chinese Medicinal Materials planting Co．Ltd.，Beijing 101300，China）

Objective：The aim of this studywas to optimize the testingmethodsof seed quality，and provide a basis for establishing seed testing rules and quality grading standard ofAnemarrhena asphodeloides．Methods：Referring to the Rules for agricultural seed testing（GB/T 3543-1995）issued by China，the items including purity analysis，weightof1 000 seeds，verification of genuineness，moisture content，percentage germination，seed viability have been tested.Results and Conclusion：Based on the study of these items，the seed testingmethods ofAnemarrhena asphodeloideshave been initially established.

Anemarrhena asphodeloides；Seed；Quality testing

國家科技重大專項(xiàng)（2009ZX09308-002）

*王文全，E-mail：wwq57＠126.com

2010-09-10）