杜鶴，崔麗娜，姚輝，宋經(jīng)元，張輝*

（1.長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春 130117；2.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所，北京 100193）

資源

基于COI條形碼序列的珍珠母及其混偽品的DNA分子鑒定△

杜鶴1，崔麗娜1，姚輝2，宋經(jīng)元2，張輝1*

（1.長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春 130117；2.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所，北京 100193）

目的：探討應用COI條形碼序列對珍珠母及其混偽品進行物種鑒定的可行性。方法：用MEGA 4.0等軟件計算珍珠母及其混偽品種內(nèi)及種間變異，構建珍珠母及其混偽品的NJ樹。結果：珍珠母種內(nèi)COI序列變異小，種間存在較多的變異位點，種間的遺傳距離顯著大于種內(nèi)的遺傳距離。通過構建的系統(tǒng)聚類樹圖可以看出，珍珠母不同來源個體均聚在一起，能夠與其混偽品區(qū)分開。結論：基于COI序列的DNA條形碼技術可以很好的鑒定珍珠母的正品來源及其混偽品。

珍珠母；DNA條形碼；COI；鑒定

珍珠母Margaritifera concha為我國常用中藥材，具有平肝潛陽，安神定驚，明目退翳的功效。用于頭痛眩暈，驚悸失眠，目赤翳障，視物昏花[1]。據(jù)《中國藥典》2010年版記載，珍珠母為蚌科動物三角帆蚌Hyriopsis cumingii（Lea）、褶紋冠蚌Cristaria plicata（Leach）或珍珠貝科動物馬氏珍珠貝Pteria martensii（Dunker）的貝殼。去肉，洗凈，干燥?，F(xiàn)市場以其混偽品和同屬做珍珠母藥用的情況較為普遍，如蜆科動物河蜆Corbicula fluminea（Muller）、蚌科動物背瘤麗蚌Lamprotula leai（Gray）等[2]。由于珍珠母正品與其混偽品的形態(tài)學特征差別很細微，用傳統(tǒng)的方法很難鑒定，所以為保正藥材的質量及其臨床療效，需要更快速、準確地方法鑒定珍珠母的正品來源與其混偽品。

DNA條形碼技術是近來發(fā)展起來的物種鑒定新方法，通過對基因組中一段短的、標準的DNA片段進行分析從而對物種進行準確鑒定[3-4]，成為生物分類和鑒定的研究熱點和方向[5-8]。本研究是應用DNA條形碼技術，對珍珠母及其混偽品的DNA條形碼COI序列進行比對分析，構建分子系統(tǒng)樹，進而對珍珠母及其混偽品進行鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料

褶紋冠蚌Cristaria plicata（Leach）藥材購自安徽亳州藥材市場，標本號AS13MT01、AS13MT02。兩種混偽品COI序列來自于GenBank，珍珠母及其混偽品信息見表1。

表1 材料來源

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取新鮮材料，去殼后用已滅菌的手術剪把樣品剪成小塊，取30 mg樣品，用液氮研碎肌肉組織[9]，再用 DNA提取研磨儀（Retsch MM400，Germany）研磨 2 min（30次·min－1）后，使用動物DNA提取試劑盒（北京天根生化公司）提取總DNA。

1.2.2 PCR擴增及測序 擴增引物COI序列通用引物：正向為 LCOI490 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，反向為 HCO2198 5′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′[10]。PCR反應體積為 25μL，體系內(nèi)含 MgCl22μL（25 mmol·L－1）、dNTP 2μL（2.5 mmol·L－1）、PCR buffer2.5μL（10×）、引物各1.0μL（2.5μmol·L－1）（北京生工生物技術公司合成）、聚合酶0.2μL（Biocolor BioScience＆Technology Co.，China）、雙蒸水13.3μL、總 DNA約1μL（～30 ng）。PCR反應條件為：94℃，1min；94℃，1 min，45℃，1.5 min，72 ℃，1.5 min，5cycles；94 ℃，1 min，50℃，1.5 min，72℃，1 min，35cycles；72℃，5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，使用ABI 3730XL測序儀（Applied Biosystems Co.，USA）雙向測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 測序峰圖利用CodonCode Aligner V 2.06拼接并校正，去除引物區(qū)，獲得長度為658bp的樣品序列。對于從GenBank獲得的COI序列，采用CodonCode Aligner V 2.06軟件，與拼接好的樣品序列比對后，去除與樣品序列相對應的658 bp以外的區(qū)段，保留長度≥550 bp的網(wǎng)上序列。最后將序列用軟件MEGA 4.0比對并進行遺傳距離等分析，并構建NJ系統(tǒng)聚類樹，同時利用bootstrap（1 000次重復）檢驗各分支的支持率。

2 結果與分析

2.1 種內(nèi)序列變異

樣品AS13MT01與AS13MT02序列長度為658 bp，含3個PolyT和1個PolyG結構，GC含量為39.6%。12個種內(nèi)序列，比對后序列長度為658 bp，有15個堿基變異位點，詳見表2。種內(nèi)平均K2P距離為0.005 4，種內(nèi)最大K2P距離為0.011 5。

表2 褶紋冠蚌種內(nèi)堿基變異情況表

2.2 種間序列變異

褶紋冠蚌與其主要混偽品COI序列間存在較多的變異位點（見圖1），種間平均K2P距離為0.356 3，最小K2P距離為0.193 4。

圖1 珍珠母及其混偽品序列間的變異位點

2.3 珍珠母及其混偽品NJ樹

基于COI序列，通過鄰接法（NJ）所構建的系統(tǒng)聚類樹圖（圖2）可以看出，珍珠母不同來源個體均聚在一起，支持率為100，同時也很容易與其余混偽品區(qū)別開來。因此COI條形碼序列適用于藥材珍珠母與其混偽品的鑒定。

圖2 基于COI序列構建的珍珠母及其混偽品的鄰接（NJ）樹

3 討論

珍珠母種內(nèi)COI序列有15個變異位點，種內(nèi)平均K2P變異為0.005 4，種內(nèi)最大K2P變異為0.011 5。說明珍珠母種內(nèi)COI序列變異很小比較穩(wěn)定。珍珠母及其混偽品COI序列種間K2P距離的平均值為0.356 3，最小 K2P距離為0.193 4。存在較多的變異位點，種間的遺傳距離顯著大于種內(nèi)的遺傳距離。同時，從基于COI序列構建的珍珠母及其混偽品NJ樹可以看出，珍珠母不同來源個體均聚在一起，支持率較高，與其它混偽品能夠很明顯區(qū)分開。因此，基于COI序列的DNA條形碼技術可以很好的鑒定珍珠母及其混偽品，為該藥材的準確鑒定提供了新的方法。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：216.

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[8]Hebert PD，StoeckleM Y，Zemlak T S，et al.Identification of birds through DNA barcodes[J].Plos Biol，2004，2（10）：1657-1663.

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Molecular Identification of Margaritifera concha and its Adulterants Using COIBarcode Sequence

DU He1，CUILi-na1，YAO Hui2，SONG Jing-yuan2，ZHANG Hui1
（1.Changchun University of Chinese Medicine，Changchun130117，China；2.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing100193，China）

Objective：This study explores the feasibility of using the COIbarcode sequence in identification of the Margaritifera concha and its adulterants.Methods：Intra-and inter-specific genetic distances ofMargaritifera concha and its adulterants have been analyzed by MEGA 4.0 software using COI sequences and the NJ tree has been constructed.Results：Margaritifera concha exhibited low intra-specific sequence variation and the inter-specific sequence have high variation between Margaritifera concha and its adulterants.The inter-specific genetic distanceswere obviously higher than the intra-specific ones.The sample of Margaritifera concha clustered together and can separated from its adulterants in the dendrogram constructed.Conclusion：As a DNA barcode，COI sequence can identify the Margaritifera concha with its adulterants.

Margaritifera concha；DNA barcoding；COI；identification

吉林省財政廳項目——藥用動物DNA條形碼鑒定技術研究

*張輝，E-mail：zhanghui＿8080＠163.com

2011-10-08）