李 楊，江連洲，*，王 梅，劉 琪

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.國(guó)家大豆工程中心，黑龍江哈爾濱150030）

堿性蛋白酶酶解綠豆分離蛋白制備多肽的工藝研究

李 楊1，2，江連洲1，2，*，王 梅1，劉 琪1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.國(guó)家大豆工程中心，黑龍江哈爾濱150030）

選用Protex-6L堿性蛋白酶對(duì)綠豆分離蛋白進(jìn)行酶法水解生成多肽,以多肽肽得率為考察指標(biāo)，對(duì)其酶解工藝進(jìn)行研究?；趩我蛩貙?shí)驗(yàn)，考察了酶解條件：pH、酶解溫度、底物濃度、加酶量、酶解時(shí)間等對(duì)酶解的影響,利用Design Expert7.1.1軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化分析。結(jié)果表明：pH9.37、酶解溫度55℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.0%、加酶量5000.02U/g條件下酶解4.76h，多肽得率可達(dá)到91.37%。

Protex-6L堿性蛋白酶，多肽得率，響應(yīng)面

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆粉 60目，自制；Protex-6L堿性蛋白酶 novo公司，1.0×105U/g；其他試劑 均為分析純。

電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LDZ5-2型臺(tái)式低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；KDN-04Ш型蛋白質(zhì)測(cè)定儀，HYP-1020二十孔消化爐 上海纖檢儀器有限公司；DU800型紫外分光光度計(jì) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；電熱恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綠豆分離蛋白的提取[6]綠豆磨粉過60目，加水溶解，將稀釋液調(diào)pH至10.0，30℃下攪拌30min。充分?jǐn)嚢韬?000r/min離心20min，取上清液，沉淀物加水調(diào)pH至10.0，同樣方法再次離心，得到的上清液與之前的合并，調(diào)pH至4.6，離心，取沉淀進(jìn)行冷凍干燥，即得綠豆分離蛋白。

1.2.2 蛋白質(zhì)測(cè)定 凱氏定氮法（GB5009.5-2010）。

1.2.3 酶活力測(cè)定 福林酚法[8]。

1.2.4 TCA-NSI測(cè)定 依據(jù)三氯乙酸（TCA）可溶性氮法（NSI）法（Jang chudA，1999），多肽得率（%）計(jì)算公式為：

式中：TCA-NSI—三氯乙酸可溶性氮得率，%；N1—在10%TCA中可溶性氮，mg；N2—原料大豆中總氮，mg。

1.2.5 酶解反應(yīng)工藝流程[9]以蒸餾水配制一定濃度的綠豆分離蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH至實(shí)驗(yàn)設(shè)定值，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的溫度加入反應(yīng)所需的酶，同時(shí)低速攪拌混合。反應(yīng)過程中以1mol/L的NaOH溶液嚴(yán)格控制酶解液的pH，酶解一定時(shí)間后，再以等體積比加入三氯乙酸（TCA，10%）并放置于60℃水浴中加熱10min，將未反應(yīng)完全的蛋白質(zhì)沉淀，用10000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，取上清，測(cè)體積，然后定氮。

1.2.6 堿性蛋白酶酶解綠豆分離蛋白單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 pH對(duì)酶解的影響 實(shí)驗(yàn)選擇在Protex-6L復(fù)合蛋白酶的工作pH范圍內(nèi)（pH8～10），以溫度65℃，底物濃度9%，酶濃度6000U/g條件下，酶解4h。分別考察了pH為8.0、8.5、9.0、9.5和10.0對(duì)酶解綠豆分離蛋白制備多肽的影響，測(cè)其多肽得率。

1.2.6.2 溫度對(duì)酶解的影響 實(shí)驗(yàn)在Protex-6L復(fù)合蛋白酶的工作溫度范圍為50～70℃，在pH9，底物濃度9%，酶濃度6000U/g條件下，酶解4h。分別考察了溫度在50、55、60、65、70℃對(duì)酶解綠豆分離蛋白制備多肽的影響，測(cè)其多肽得率。

1.2.6.3 底物濃度對(duì)酶解的影響 實(shí)驗(yàn)選擇底物濃度范圍為6%～10%，在pH9，酶解溫度60℃，酶濃度6000U/g條件下，酶解4h。分別考察了底物濃度在6%、7%、8%、9%和10%時(shí)對(duì)酶解綠豆分離蛋白制備多肽的影響，測(cè)其多肽得率。

1.2.6.4 加酶量對(duì)酶解的影響 實(shí)驗(yàn)選擇酶濃度范圍為4000～8000U/g，在pH9，酶解溫度60℃，底物濃度9%條件下，酶解4h。分別考察加酶量在4000、5000、6000、7000、8000U/g對(duì)酶解綠豆分離蛋白多肽的影響，測(cè)其多肽得率。

1.2.6.5 酶解時(shí)間對(duì)酶解的影響 實(shí)驗(yàn)選擇在pH9，酶解溫度60℃，底物濃度8%，酶濃度6000U/g條件下，分別酶解2、3、4、5、6h?？疾炱鋵?duì)酶解綠豆分離蛋白多肽的影響，測(cè)其多肽得率。

1.2.7 響應(yīng)面分析法 以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，利用Design Expert7.1.1軟件設(shè)計(jì)，進(jìn)一步對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表1。

表1 因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 Protex-6L堿性蛋白酶酶解綠豆分離蛋白制備多肽的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 pH對(duì)多肽得率的影響 pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響主要有：在不適的酸堿環(huán)境中，酶的空間構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變，可能導(dǎo)致酶失活；同時(shí)pH決定了底物與酶的解離狀態(tài)，影響它們的結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)的水解程度，對(duì)制得的多肽質(zhì)量有所影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見圖1）表明，Protex-6L堿性蛋白酶在pH=9.0時(shí)多肽得率較高。

圖1 pH對(duì)酶解反應(yīng)的影響

2.1.2 溫度對(duì)酶解的影響 溫度對(duì)酶促反應(yīng)影響的原因概括地說主要有兩個(gè)方面：一是溫度對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性的影響，即對(duì)酶熱變性失活作用；二是溫度對(duì)酶促反應(yīng)本身的影響，其中可能包括影響酶和底物的結(jié)合，影響最大速率（Vmax），影響酶和底物分子解離基團(tuán)的解離常數(shù)（pK），影響酶與抑制劑、激活劑或輔酶的結(jié)合等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見圖2）表明，Protex-6L堿性蛋白酶在溫度為65℃時(shí)多肽得率較高。

圖2 溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響

2.1.3 底物濃度對(duì)酶解的影響 過高的底物濃度易造成水解液黏度增大，影響蛋白酶的擴(kuò)散，對(duì)蛋白質(zhì)鏈斷裂反應(yīng)有抑制作用。在底物濃度一定的時(shí)候，理論上酶分子越多，則酶與底物之間作用越頻繁。隨著底物濃度的減少，底物相對(duì)酶的濃度減少。當(dāng)?shù)孜餄舛刃〉揭欢ǔ潭葧r(shí)，酶的數(shù)量就趨于過剩，單位時(shí)間內(nèi)一部分酶分子不與底物結(jié)合，造成蛋白質(zhì)鏈斷裂反應(yīng)變緩慢。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見圖3）表明，Protex-6L堿性蛋白酶在底物濃度8%時(shí)多肽得率較高。

圖3 底物濃度對(duì)酶解的影響

2.1.4 加酶量對(duì)酶解的影響 在蛋白質(zhì)的酶解實(shí)驗(yàn)中，增大酶濃度可以增加酶與底物之間結(jié)合的幾率，從而增強(qiáng)酶解程度。當(dāng)酶濃度增加到一定值后，上升的趨勢(shì)減緩。因此，對(duì)于酶的添加量需要進(jìn)行權(quán)衡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見圖4）表明，Protex-6L堿性蛋白酶在酶濃度在6000、7000U/g時(shí)多肽得率較高，但是增長(zhǎng)趨勢(shì)不明顯，為了經(jīng)濟(jì)效應(yīng)考慮，選擇6000U/g酶濃度為好。

圖4 加酶量對(duì)酶解的影響

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)酶解的影響 隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度逐漸增大，這是由于隨時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶逐漸作用，直至酶全部飽和，這時(shí)蛋白水解度達(dá)最大值，但隨著時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，由于有少量水解的肽鏈又重新連接，導(dǎo)致其水解度不再增高，反而略微下降，使得多肽得率下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見圖5）表明，Protex-6L堿性蛋白酶在4h多肽得率達(dá)最高值，再繼續(xù)酶解，多肽得率有所下降。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)酶解的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，本實(shí)驗(yàn)以多肽得率Y為響應(yīng)值，利用Design Expert7.1.1軟件設(shè)計(jì)了5因素3水平的響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)，共有46個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中40個(gè)為析因點(diǎn)，6個(gè)為零點(diǎn)以估計(jì)誤差。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值結(jié)果

2.2.1 方差分析 利用軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析后得到模型的二次多項(xiàng)回歸方程為：

表3 方差分析表

由表3可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著，并且該模型R2=93.82%，R2Adj=88.87%，說明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于該反應(yīng)的理論推測(cè)。由F檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為：x4＞x5＞x3＞x1＞x2，即加酶量＞酶解時(shí)間＞底物濃度＞酶解pH＞酶解溫度。

2.2.2 響應(yīng)面分析 應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化分析方法對(duì)回歸模型進(jìn)行分析如圖4，可以看出pH（x1）與酶解溫度（x2）、pH（x1）與加酶量（x4）、酶解溫度（x2）與底物濃度（x3）、酶解溫度（x2）與酶解時(shí)間（x5）以及加酶量（x4）與酶解時(shí)間（x5）的交互作用對(duì)水解度的影響。由此可知，酶解溫度在55～65℃范圍內(nèi)，酶解時(shí)間對(duì)水解度的因子貢獻(xiàn)率雖然小，但酶解溫度與其他因素的交互作用對(duì)多肽得率影響較大。

2.2.3 最佳水解條件的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證 用DesignExpert7.1.1軟件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化方案有29組，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：pH9.37、酶解溫度為55℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.0%、酶量5000.02U/g、酶解時(shí)間為4.76h、肽得率最優(yōu)值為91.37%。說明優(yōu)化后的回歸方程對(duì)綠豆分離蛋白的水解進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)是非常可靠的。

3 結(jié)論

圖6 各酶解參數(shù)交互顯著項(xiàng)對(duì)多肽得率的響應(yīng)面分析

選用Protex-6L堿性蛋白酶對(duì)綠豆分離蛋白進(jìn)行酶法水解制備多肽，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明是可行的，其多肽得率可達(dá)到91.37%。且Protex-6L堿性蛋白酶是現(xiàn)有蛋白酶中水解度較高、穩(wěn)定性好、應(yīng)用廣泛的一種，為以后工業(yè)化生產(chǎn)可提供一定的理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)所得的最優(yōu)條件是pH9.37、酶解溫度為55℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.0%、酶量5000.02U/g、酶解時(shí)間為4.76h。

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Study on preparation of small peptides by hydrolyzing isolate mung bean protein with Protex-6L proteinase

LI Yang1,2,JIANG Lian-zhou1,2,*,WANG Mei1,LIU Qi1
（1.Food College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Soy Bean Engineering Technique Research Center，Harbin 150030，China）

Protex-6L proteinase was used to hydrolyzing isolated mung bean protein，in order to prepare small peptides.Index was investigated by peptide yield，its enzymatic hydrolysis was studied.Based on single factor experiments，the effects of hydrolysis conditions:pH，reaction temperature，substrate concentration，enzyme dosage，reaction time were studied.Design by Design Expert7.1.1 to optimize the response of the face of hydrolysis conditions.The results showed that pH 9.37，reaction temperature 55℃，7.0%substrate concentration，enzyme 5000.02U/g under the conditions of hydrolysis 4.76h，peptide yield was 91.37%.

Protex-6L protease；peptide yield；response surface

TS201.2+5

B

1002-0306（2011）10-0384-05

綠豆（Vignaradiata）又名青小豆，古名菉豆、植豆，屬豆科豇豆屬，原產(chǎn)于我國(guó)，種植歷史悠久，分布廣泛，產(chǎn)量豐富。綠豆?fàn)I養(yǎng)成分全面，蛋白質(zhì)含量達(dá)19.5%～33.1%，功效比為1.87，遠(yuǎn)高于小麥、稻谷、玉米等糧食作物；且氨基酸種類齊全、配比均衡[1]，特別是賴氨酸的含量較為豐富，接近雞蛋蛋白質(zhì)[2]。其味甘、性寒，有清熱解毒、消暑止渴、利尿消腫、解毒保肝之功效，具有良好的食用和藥用價(jià)值。目前對(duì)綠豆的利用多側(cè)重于綠豆淀粉，而忽略了綠豆蛋白的開發(fā)，造成了資源浪費(fèi)，增加了下游處理成本[3]。綠豆肽是綠豆分離蛋白經(jīng)水解而成的低聚肽混合物，相比綠豆蛋白，其氨基酸組成與結(jié)構(gòu)幾乎沒有改變，但相對(duì)分子質(zhì)量較小，具有水溶性高、黏度低、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。其吸收機(jī)制優(yōu)于游離氨基酸[4]，有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、降膽固醇等作用[5]，用作食品原料，還可以降低食品硬度，改善口感，因此具有廣闊的市場(chǎng)開發(fā)前景?，F(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究表明，人體攝入的蛋白質(zhì)經(jīng)消化道中的酶作用后，大多是以寡肽的形式被消化吸收，而以游離氨基酸形式被吸收的比例很小，因此開發(fā)有益于人類健康的功能性肽具有廣闊的市場(chǎng)前景[6-7]。本文采用Protex-6L復(fù)合蛋白酶，酶解綠豆分離蛋白制備低聚肽和氨基酸混合物，作為食物添加劑，具有廣泛的用途。

2011-08-01 *通訊聯(lián)系人

李楊（1981-），男，講師，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。