魯晶晶，鄭喜群,*，劉曉蘭，劉志勝

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江省高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006；2.美國北達科他州立大學谷物與食品科學系，美國北達科他州581052）

堿溶酸沉法提純玉米浸泡水粗蛋白的工藝優(yōu)化

魯晶晶1，鄭喜群1,*，劉曉蘭1，劉志勝2

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江省高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006；2.美國北達科他州立大學谷物與食品科學系，美國北達科他州581052）

以玉米浸泡水粗蛋白為原料，通過單因素實驗初步確定堿溶酸沉法提純玉米浸泡水粗蛋白的條件。在單因素基礎上選取影響蛋白質(zhì)提純效果明顯的三個因素：堿溶階段pH、浸提時間、料液比，進行響應面設計。得到了優(yōu)化的提純條件：溫度45℃，堿溶階段pH12，浸提時間20min，料液比（W∶V）1∶35、酸沉階段pH5.5。在此條件下，玉米浸泡水的蛋白質(zhì)含量為91.84%，提取率為70.06%。

玉米浸泡水，蛋白，提純，優(yōu)化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米浸泡水 青岡龍鳳淀粉廠；玉米浸泡水粗蛋白 實驗室自制，殼聚糖絮凝提取冷凍干燥后，100目過篩，蛋白質(zhì)26.44%、水分9.34%、總糖0.62%、總酸1.15%、脂肪1.02%、灰分30.66%；其他試劑 分析純。

Wmzk-72電熱恒溫水浴鍋 上海躍進機械廠；Thermo702型低溫冰箱 賽默飛世爾科技公司；TDL-5-A臺式離心機 上海安亭科技儀器廠；PHS-3C型pH計 上海精密科學儀器有限公司；全自動凱氏定氮儀 瑞士步琪公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米浸泡水粗蛋白的制備

1.2.1.1 玉米浸泡水粗蛋白的制備 用殼聚糖絮凝的方法從玉米浸泡水中提取[5]。取玉米浸泡水1000mL，調(diào)節(jié)浸泡水pH6.9，添加10g/L殼聚糖溶液，60r/min攪拌35min，靜置30min，離心，沉淀物干燥，粉碎，100目過篩，于常溫保存?zhèn)溆?。玉米浸泡水粗蛋白中蛋白質(zhì)含量的測定采用常量凱氏定氮法。

1.2.1.2 玉米浸泡水粗蛋白的提純步驟 稱取2.0g玉米浸泡水粗蛋白，溶于蒸餾水中，用0.5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH，恒溫水浴振蕩浸提20min，然后3500r/min離心20min，殘渣按上述方法再提取一次，合并兩次提取的上清液，用0.5mol/L HCl分別調(diào)pH，靜置30min，有沉淀析出，3500r/min離心20min，棄去上清液，沉淀冷凍干燥，玉米浸泡水蛋白，進行三次平行實驗。

1.2.2 堿溶酸沉單因素實驗

1.2.2.1 堿溶階段最適pH的確定 按料液比1∶25（w∶v），分別調(diào)節(jié)pH至9、10、11、12、13、14，于25℃浸提30min，酸沉階段調(diào)pH至5.0，研究堿溶階段pH對蛋白質(zhì)提取率及蛋白質(zhì)純度的影響，確定適宜的堿溶階段pH。

1.2.2.2 適宜溫度的確定 堿溶階段pH為12，分別選擇溫度為25、35、45、55、65℃，其他條件同1.2.2.1，確定適宜的浸提溫度。

1.2.2.3 適宜料液比的確定 分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（w/v），堿溶階段pH為12，浸提溫度為45℃，其他條件同1.2.2.1，確定適宜的料液比。

1.2.2.4 適宜浸提時間的確定 按料液比1∶35（w/v），堿溶階段pH為12，浸提溫度45℃，分別選擇浸提時間為10、20、30、40、50、60min，其他條件同1.2.2.1，確定適宜的浸提時間。

1.2.2.5 適宜酸沉階段pH的確定 按料液比1∶35（w/v），堿溶階段pH為12，浸提溫度為45℃，浸提時間為20min，分別調(diào)酸沉階段pH至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，確定適宜的酸沉階段pH。

1.2.3 響應面實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用Box-Behnken進行實驗設計。以料液比、堿溶階段pH、浸提時間為自變量，提純后玉米浸泡水蛋白純度為響應值，設計3因素3水平共15個實驗點的響應面分析實驗[6]。利用Design Exeprt軟件進行數(shù)據(jù)處理和回歸分析。實驗設計方案如表1所示。

表1 實驗因素和水平

1.2.4 玉米浸泡水粗蛋白的分析

1.2.4.1 玉米浸泡水粗蛋白成分的分析[7]水分、灰分、總糖、總酸、脂肪、蛋白質(zhì)的測定分別按照GB5009.3-2003直接干燥法、GB5009.4-2003、蒽酮-硫酸法、滴定法、GB5512-1985索氏提取法、GB5009.5-85常量凱氏定氮法測定。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)提取率的計算

式中：C0-玉米浸泡水粗蛋白的蛋白質(zhì)含量，%（w/w）；C1-提純后樣品蛋白質(zhì)含量，%（w/w）。

1.2.4.3 蛋白質(zhì)純度 堿溶酸沉提純后的玉米浸泡水蛋白質(zhì)樣品中蛋白質(zhì)含量（用常量凱氏定氮法測定）。

2 結(jié)果與討論

2.1 堿溶酸沉提純玉米浸泡水粗蛋白的單因素實驗結(jié)果

2.1.1 堿溶階段適宜pH的選擇 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，pH的變化會改變其帶電情況，直接影響蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-溶劑的相互作用，從而使蛋白質(zhì)的溶解性發(fā)生變化。因此，有必要研究堿溶階段pH對蛋白質(zhì)純度及回收率的影響。按照1.2.2.1實驗方法進行實驗，堿溶階段適宜pH對玉米浸泡水粗蛋白提純效果的影響如圖1所示。

圖1 堿溶階段pH對玉米浸泡水粗提純效果的影響

由圖1可知，隨著pH從9增加到12，樣品蛋白純度和提取率均逐漸增大，堿液對蛋白質(zhì)分子的次級鍵特別是氫鍵具有破壞作用，并可使某些極性基團發(fā)生解離，使蛋白質(zhì)表面分子具有相同的電荷，從而對蛋白質(zhì)分子具有增溶的作用。所以，隨著溶液pH的逐漸增大，提取率及蛋白純度也逐漸增大；pH大于12時，蛋白純度和提取率均減??；當pH14時，蛋白純度最小，甚至比玉米浸泡水粗蛋白的純度還低。分析可能是pH過高使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，導致蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)象遭到破壞，失去原來的天然性質(zhì)，使得最后得到的蛋白純度極低。因此，確定pH12為適宜堿溶階段pH。

2.1.2 適宜溫度的選擇 按照1.2.2.2實驗方法進行實驗，溫度對玉米浸泡水粗蛋白提純效果的影響如圖2所示。

由圖2可以看出，隨著溫度的升高，蛋白純度及提取率均有所下降，但變化不明顯。蛋白質(zhì)在不同溫度條件下有不同的溶解度，尤其對于含有較多疏水性氨基酸的玉米浸泡水粗蛋白來講，在堿性條件下的溶解性比較好，但當溫度升高時疏水基團會暴露出來，形成由二硫鍵連接的高分子量不溶聚合物，使蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度下降，在堿溶過程結(jié)束后，離心棄去沉淀收集上清液的環(huán)節(jié)中損失掉，將這部分不溶的固形物離心棄去，導致堿溶酸沉后的蛋白純度及提取率降低。在實驗所選擇的溫度范圍內(nèi)，25℃時，蛋白純度及提取率均最高。但考慮到淀粉廠生產(chǎn)淀粉時產(chǎn)生的玉米浸泡水的實際溫度為45℃，所以，最終確定適宜的提取溫度為45℃，更有益于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

圖2 溫度對玉米浸泡水粗蛋白提純效果的影響

2.1.3 適宜料液比的選擇 料液比在一定范圍內(nèi)的提高可以大大提高蛋白質(zhì)的提取率，較高的料液比可以降低體系的粘度，加快傳質(zhì)的過程；料液比小時，溶液的粘度較大，將影響傳質(zhì)過程的進行；而適宜的料液比可以促進原料與溶液的接觸[8]。所以，選擇適宜的料液比尤為重要。按照1.2.2.3實驗方法進行實驗，料液比對玉米浸泡水粗蛋白提純效果的影響如圖3所示。

圖3 料液比對玉米浸泡水粗蛋白提純效果的影響

由圖3可知，在實驗所選的料液比范圍內(nèi)，隨著料液比的增大，樣品蛋白質(zhì)的純度及提取率呈先增大后減小的趨勢。料液比為1∶35時蛋白純度及提取率都最大，繼續(xù)增加料液比，兩項指標都有下降。含水量多少直接影響傳質(zhì)過程的相互作用，料液比過大時，料液體系分散不均勻，不利于蛋白質(zhì)的充分溶解，使得蛋白質(zhì)的提取率偏低，提取出來的樣品中有效蛋白含量沒有增加；同時，料液比過大，提取時消耗大量的堿和水，所得提取液的蛋白質(zhì)濃度非常低，大大增加了后處理的負擔，產(chǎn)品成本增加，會帶來一定的負面影響。因此，適宜料液比為1∶35。

2.1.4 適宜浸提時間的選擇 按照1.2.2.4實驗方法進行實驗，浸提時間對玉米浸泡水粗蛋白提純效果的影響如圖4所示。

圖4 浸提時間對玉米浸泡水粗蛋白提純效果的影響

由圖4可以看出，隨浸提時間的延長，蛋白質(zhì)純度及提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在50min時提取率又有微小的增加，之后提取率繼續(xù)下降。分析得出上述結(jié)果的原因：第一可能是溶劑接觸到蛋白質(zhì)需要一定的時間，才能使蛋白質(zhì)逐步水化而緩慢地溶出，時間過短，溶劑與蛋白質(zhì)接觸不充分，溶質(zhì)溶解效果不好；浸提時間過長，溶質(zhì)飽和，溶解效果反而下降，導致溶質(zhì)緩慢溶出，降低了溶質(zhì)的溶解度；第二可能是樣品結(jié)構(gòu)的松散程度越來越接近于極限，蛋白質(zhì)從樣品中進入提取液主體的傳質(zhì)速率明顯降低，使提取率增加平緩[9]。因此，確定適宜浸提時間為20min。

2.1.5 適宜酸沉階段pH的選擇 本文選取堿溶液將蛋白質(zhì)充分溶解，為了收集蛋白質(zhì)就需要將其從堿溶液中析出，所以酸沉階段pH也有可能影響著蛋白質(zhì)的純度及提取率，也就有必要考察酸沉階段pH對蛋白質(zhì)提純效果的影響，按照1.2.2.5實驗方法進行實驗，如圖5所示。

圖5 酸沉階段pH對玉米浸泡水粗蛋白提純效果的影響

由圖5可以看出，酸沉階段玉米浸泡水粗蛋白的蛋白純度及提取率隨pH變化呈先增大后減小的趨勢，在pH5.5時，均達到最大值，分別為88.00%、68.74%。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在某一pH的溶液中，它所帶的正電荷與負電荷數(shù)恰好相等，即凈電荷為零，此時蛋白質(zhì)間靜電排斥作用最低，蛋白質(zhì)聚集、沉淀，溶解度最低，從溶液中析出。因此，酸沉階段適宜pH為5.5。

2.2 響應面法優(yōu)化堿溶酸沉提純玉米浸泡水粗蛋白的適宜條件

2.2.1 實驗結(jié)果 采用三因素三水平的響應面法，優(yōu)化堿溶酸沉提純玉米浸泡水粗蛋白的工藝條件。按照1.2.3方法實驗，結(jié)果見表2。

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗 運行Design Exeprt軟件，對表2的結(jié)果進行二次項擬合，在α=0.05水平上用逐步回歸法予以簡化，求得玉米浸泡水蛋白純度對料液比（A）、堿溶階段pH（B）、浸提時間（C）的二次多項回歸模型：

對該回歸模型及回歸方程的各項系數(shù)進行方差分析、顯著性檢驗，結(jié)果如表3所示。

表3 方差分析結(jié)果

從表3可以看出：模型P=0.0011＜0.01，表明模型方程高度顯著，即不同條件對玉米浸泡水粗蛋白提純效果影響高度顯著；整個模型的R2為0.9791，說明模型可以解釋97.91%實驗所得玉米浸泡水蛋白提取純度的變化，模型的擬合度較好，可以用于堿溶酸沉法提純玉米浸泡水粗蛋白實驗的理論預測。

由表3的回歸方程的各項系數(shù)顯著性檢驗可知，二次項（P=0.0002＜0.05）對玉米浸泡水粗蛋白提純效果影響高度顯著，一次項（P=0.0451＜0.05）影響較顯著，而交互項（P=0.2078＞0.05）作用不顯著。

2.2.3 玉米浸泡水粗蛋白堿溶酸沉提純工藝的響應面分析與優(yōu)化 根據(jù)回歸模型，做出相應的響應曲面圖，如圖6所示。

由圖6可知，各因素對響應值的影響趨勢可通過這組圖直接反映出來。B（堿溶階段pH）對響應值的影響較大，表現(xiàn)為曲線較陡；A（料液比），C（浸提時間）對響應值的影響均較小，表現(xiàn)為曲線相對平滑。另外，回歸方程存在穩(wěn)定點，即極大值點，通過嶺嵴分析（ridge analysis）得到極大值。所對應的各主要因素 （A，B，C） 的編碼值分別為 （0.020158，-0.103079，0.009576），即適宜條件是：料液比（W∶V）1∶35.10﹑堿溶階段pH 11.90﹑浸提時間20.10min，在此條件下，蛋白質(zhì)純度的理論值為92.38%。為檢驗響應曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提純條件進行玉米浸泡水粗蛋白提純，考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為：料液比（W∶V）1∶35，pH12，時間20min。在此條件下提純，實際測得的樣品蛋白質(zhì)含量為91.84%，與理論值較接近。因此，基于響應面法所得的優(yōu)化提純工藝參數(shù)準確可靠，進一步驗證了數(shù)學回歸模型的合適性。

圖6 玉米浸泡水粗蛋白經(jīng)堿溶酸沉提純后沉淀的蛋白純度的響應面圖

3 結(jié)論

通過單因素實驗及響應面實驗優(yōu)化了堿溶酸沉方法提純玉米浸泡水粗蛋白的適宜工藝條件。即：溫度45℃；堿溶階段pH12；浸提時間20min；料液比（W∶V）l∶35；酸沉階段pH5.5，提純后玉米浸泡水蛋白的純度可達到91.84%，達到了玉米浸泡水分離蛋白的水平。

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Optimization of purification technology for corn steep water crude protein by alkali-solution and acid-isolation

LU Jing-jing1,ZHENG Xi-qun1,*,LIU Xiao-lan1,LIU Zhi-sheng2
（1.Heilongjiang Provincial Key University Laboratory of Processing Agricultural Products,College of Food and Bioengineering,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China；2.North Dakota State University,ND 581052,USA）

The corn steep water crude protein was purified by alkali-solution and acid-isolation.The preliminary conditions were determined through single factor test.By using of response surface analysis experiment，the effects of alkali soluble pH，extracting time，solid-liquid ratio on the protein purity were studied on the base of the single-factor test.The results showed that the optimum conditions were as following:temperature 25℃，alkali soluble pH 12，extraction time 20min，solid-liquid ratio(W∶V)1∶35 and acid subside pH 5.5.Under the best conditions，the protein purity was 91.84%and the yield of protein was 70.06%.

corn steep water；protein；purification；optimization

TS210.1

B

1002-0306（2011）10-0321-05

在玉米淀粉濕法生產(chǎn)過程中，首先需要浸泡，每處理1t玉米，約產(chǎn)生0.8m3的浸泡水[1]。玉米浸泡水中含有大量有價值的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、可溶性氨基等。目前，大多數(shù)淀粉廠（尤其是小型淀粉廠）不能對玉米浸泡水進行充分開發(fā)利用，而是將玉米浸泡水濃縮成玉米漿作為飼料出售或者直接排放掉，這樣不僅耗費大量熱源，造成資源的浪費，還會導致環(huán)境污染[2]。因此，對玉米浸泡水加以利用，尤其是將其中3%～4%的蛋白質(zhì)提取出來就顯得尤其重要，既可以變廢為寶，減少環(huán)境危害，還能大大提高經(jīng)濟效益。玉米浸泡水中蛋白質(zhì)的提取方法，主要有等電點法、三氯乙酸沉淀法等。等電點法分離出的蛋白質(zhì)不到玉米浸泡水中蛋白質(zhì)總量的40%，大部分造成浪費；三氯乙酸沉淀法，蛋白質(zhì)回收率為65.3%[3]，但三氯乙酸本身有微毒，給蛋白質(zhì)的利用帶來一定的問題，不能直接加以利用。本課題組也研究過利用殼聚糖絮凝劑直接從玉米浸泡水中提取玉米浸泡水蛋白，但是得到的蛋白純度不夠，提取率不高。因此，有必要尋求一種安全可靠、成本低、易于實現(xiàn)操作的提取玉米浸泡水蛋白質(zhì)的方法。堿溶酸沉法是分離提取蛋白質(zhì)應用的最多而且已用于產(chǎn)業(yè)化的方法，該法具有操作簡單、易于控制、成本低廉等優(yōu)點[4]。本實驗以采用殼聚糖絮凝方法提取的玉米浸泡水粗蛋白為原料，利用堿溶酸沉的方法，進一步提純玉米浸泡水粗蛋白，并用響應面法優(yōu)化提純工藝條件，探討堿溶階段pH、浸提時間、料液比等因素對提純后玉米浸泡水蛋白質(zhì)含量的影響，確定適宜工藝參數(shù)，為玉米浸泡水蛋白的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和參考。

2010-12-28 *通訊聯(lián)系人

魯晶晶（1986-），女，碩士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏方面的研究工作。

黑龍江省海外學人資助項目（1153h24）。