趙 輝，藺善喜，王 葳，凌宏志，平文祥，*

（1.黑龍江大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱150080；2.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱150500）

低高級醇啤酒酵母的選育及中試發(fā)酵

趙 輝1，2，藺善喜1，2，王 葳1，2，凌宏志1，2，平文祥1，2，*

（1.黑龍江大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱150080；2.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱150500）

利用紫外和硫酸二乙酯對出發(fā)酵母菌株進行復合誘變，三重篩選獲得高級醇產(chǎn)量少的菌株。同時采用響應面分析方法對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)。中試發(fā)酵得到總高級醇含量70.67mg/L，感官和其它理化指標優(yōu)良的啤酒。

高級醇，啤酒酵母，誘變，響應面法，中試發(fā)酵

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大麥芽 哈爾濱龍墾麥芽有限公司；菌種Saccharomgces Carlsbergensis HF2.3，黑龍江大學發(fā)酵工程實驗室保存菌種；正丙醇、甲醇、乙醛、異丁醇、異戊醇、乙酸丁酯 色譜純；其余藥品 均為分析純；MM（麥芽汁培養(yǎng)基） 料水比1∶3.5，升溫浸出糖化法制備12°P麥芽汁；CM（酵母完全培養(yǎng)基，g·L-1）蛋白胨20，酵母膏10，葡萄糖20，pH 6.0；LM（乳酸培養(yǎng)基，g·L-1） 乳酸鈣40，酵母膏0.2，瓊脂30，pH 6.0；MCM（麥芽汁碳酸鈣培養(yǎng)基） 在MM固體培養(yǎng)基中加入干熱滅菌后的碳酸鈣（1.5g·L-1）；TTC（TTC上層培養(yǎng)基，g·L-1） TTC 0.5，乳酸5，瓊脂15，pH 6.0。

DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；UV755B紫外分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)有限公司；LD24-08醫(yī)用離心機 北京醫(yī)用離心機廠；GC7890氣相色譜儀 上海天美科學儀器有限公司；GUQS-15A全自動式5L發(fā)酵罐 鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司；SBA-40C型生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所；JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；1000L不銹鋼全自動錐形微型啤酒設(shè)備 哈爾濱漢德釀造設(shè)備有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗條件

1.2.1.1 高級醇的檢測 氣相色譜法分析條件：以乙酸丁酯為內(nèi)標，氫火焰離子檢測器，PEG20M（聚乙二醇）毛細管色譜柱Ф0.25mm×（25～30）m，程序升溫條件70℃（2min）至100℃（5℃/min），進樣器溫度180℃，檢測器溫度180℃，載氣流速（高純氮）0.5～1.0mL/ min，分流比20∶1～100∶1，進樣量0.3μL。

1.2.1.2 其它理化成分分析 電位滴定法測定總酸含量；皂化法測定總酯含量；碘量法測定總?cè)┖?；鄰苯二胺法測定雙乙酰含量；密度瓶法測定外觀發(fā)酵度及酒精度。

1.2.2 菌株復合誘變及篩選 取15mL酵母菌懸液于無菌培養(yǎng)皿中，用事先預熱20min的15W紫外燈進行誘變處理，照射距離25cm。采用不同的照射處理時間（0、10、20、30、40、50、60、90、120s），用生理鹽水10倍系列梯度稀釋并取100μL進行平板涂布計數(shù)，做酵母致死曲線。選擇致死率約80%～90%處理時間的誘變菌進行復合誘變。

用磷酸緩沖液制備的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、1%的DES各50mL，分別加入5mL生理鹽水洗滌實驗菌，處理20min后，迅速加入5mL 25%的硫代硫酸鈉脫毒5～10min，用生理鹽水10倍系列梯度稀釋并取100μL進行平板涂布計數(shù)，做酵母致死曲線，選擇致死率約80%～90%處理時間的誘變菌進行篩選。

初篩：將誘變處理過的酵母細胞均勻涂布在LM平板上，置黑暗處30℃培養(yǎng)3～5d。挑選生長菌落較大、菌層較厚、表面光滑和邊緣整齊的菌落約40～50株轉(zhuǎn)接于MCM平板上，于30℃培養(yǎng)3d，菌落影印到LM平板上，30℃培養(yǎng)3d。菌落長成后加入TTC暗培養(yǎng)2～3h，挑選在MCM上生長較好、中央隆起突出、溶鈣圈適中、TTC上紅色較深的菌株[15]。

復篩：選取初篩菌株用MM 200mL在室溫下培養(yǎng)5～6d后進行高級醇含量檢測，選擇高級醇含量低的突變株。

1.2.3 誘變后菌株性能的研究

1.2.3.1 穩(wěn)定性實驗 將篩選出的優(yōu)良菌株連續(xù)傳代5次，進行發(fā)酵實驗來檢測突變菌的優(yōu)良特性，考察其遺傳穩(wěn)定性。

1.2.3.2 誘變后菌株發(fā)酵成分分析 將誘變后的突變株進行啤酒發(fā)酵實驗，進行包括高級醇等成分在內(nèi)的理化分析，鑒定誘變后菌株的特性。

1.2.3.3 乳酸脫氫酶活性的研究 將菌懸液放在冰水浴中，200W連續(xù)超聲破碎15min（破碎2s，間隔1s），破碎后溶液離心，得到上清液即為酶液，分光光度法測定酶活力。

1.2.3.4 乳酸產(chǎn)量的研究 利用SBA-40C型生物傳感分析儀，發(fā)酵液經(jīng)離心除雜后，調(diào)節(jié)pH在6～8之間，用定量進樣針準確吸取25μL，并注入反應盒內(nèi)。含有樣品的底物在樣品室內(nèi)迅速混合均勻，被測定的對象透過酶膜圈的外層與固定化酶層接觸并反應，反應放出的水再透過酶膜的內(nèi)層與白金-銀電極接觸，并產(chǎn)生電流信號，該電流信號與底物濃度成線性比例關(guān)系，經(jīng)微機處理的信號，可直接顯示打印出來。

1.2.4 響應面法優(yōu)化啤酒發(fā)酵條件 以Plackett-Burman實驗確定發(fā)酵溫度、氨基酸含量和接種量是影響啤酒發(fā)酵高級醇生成量的主要因素，并根據(jù)最陡爬坡實驗篩確定中心組合設(shè)計的因素和水平，并進行響應面分析（利用SAS軟件進行實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)處理），確定發(fā)酵最優(yōu)條件，中心組合設(shè)計實驗因素及水平見表1。

表1 中心組合設(shè)計實驗因素及水平

1.2.5 中試啤酒發(fā)酵工藝流程 利用具有全夾套制冷，C.I.P自動清洗系統(tǒng)的1000L不銹鋼錐體啤酒發(fā)酵罐，進行啤酒中試發(fā)酵，并進行理化指標分析，工藝流程見圖1。

圖1 中試啤酒發(fā)酵流程圖

2 結(jié)果與討論

2.1 誘變后菌株穩(wěn)定性及發(fā)酵性能研究

圖2 乳酸脫氫酶活力與高級醇變化趨勢

圖3 發(fā)酵過程中乳酸變化趨勢

復合誘變后得到的啤酒酵母命名為HF2.32，將HF2.32連續(xù)傳五代后，發(fā)酵實驗表明傳代前后菌株的發(fā)酵性能無明顯差異，表明HF2.32具有遺傳穩(wěn)定性。

本實驗中，通過誘變提高菌株乳酸脫氫酶的活性來降低高級醇的含量，要篩選的目標菌株乳酸脫氫酶活性顯著增加，丙酮酸向乳酸轉(zhuǎn)變，使乳酸積累增加，消耗丙酮酸和還原性輔酶，造成高級醇的合成量下降。由于乳酸合成反應的可逆性，主酵期后乳酸脫氫酶催化多余的乳酸逆反應形成丙酮酸，進一步合成酒精和CO2，而高級醇的合成反應是不可逆的，且主要在主酵期形成，其含量仍然保持低水平。由圖2可知，經(jīng)過誘變選育的突變菌株HF2.32高級醇產(chǎn)量比原始菌株降低了26.2%，乳酸脫氫酶活力比原始菌株提高了6.8個活力單位，由圖3可知，誘變菌株的乳酸產(chǎn)量開始比出發(fā)菌株要高0.8mg/100mL，同時發(fā)酵實驗表明HF2.3包括雙乙酰在內(nèi)的其他理化指標基本保持不變，證明復合誘變成功。

2.2 響應面法優(yōu)化啤酒發(fā)酵條件

響應面分析結(jié)果如表2和圖4所示，分析得到回歸方程如下：

圖4 y=f（x1，x2，x3）響應面圖

由方差分析可知，方程二次項和交互項影響顯著，一次項影響一般，說明響應值的變化相對復雜，各個具體實驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關(guān)系?；貧w方程的決定系數(shù)R2=0.9423，且F檢驗極顯著，說明對實驗擬合情況良好。由響應面結(jié)果得到啤酒發(fā)酵最優(yōu)條件為：發(fā)酵溫度10.91℃，氨基酸含量172.83mg/L，接種后細胞濃度5.66×106個/mL，理論高級醇產(chǎn)量為72.23mg/L。

表2 優(yōu)化實驗結(jié)果

表3 各因素顯著性比較結(jié)果

表4 回歸方程各項的方差分析表

2.3 中試啤酒發(fā)酵分析

中試發(fā)酵啤酒高級醇含量如表5所示，菌株HF2.32總高級醇含量和正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇的含量均明顯低于出發(fā)菌株，同時外觀發(fā)酵度74%、酒精度4%、雙乙酰0.071mg/L、總酯29.1mg/L、總?cè)?8.51mg/L、總酸3.15mg/L，各項指標均達到國家標準。酒液淡黃、清澈透明、富有光澤，酒質(zhì)柔和、濃香醇厚、有明顯酒花香和麥芽香，且具有啤酒特有的爽口苦味和殺口力。

表5 中試發(fā)酵啤酒高級醇含量

3 結(jié)論

以實驗室保藏的卡爾酵母為出發(fā)菌株，對其進行紫外-DES誘變處理，通過誘變提高菌株乳酸脫氫酶的活性來降低高級醇的含量，經(jīng)乳酸鈣培養(yǎng)基、麥芽汁碳酸鈣培養(yǎng)基和TTC-上層培養(yǎng)基三重篩選，得到總高級醇產(chǎn)量降低26.2%的菌株HF2.32。響應面優(yōu)化該菌株低產(chǎn)高級醇的發(fā)酵條件為：接種后細胞濃度5.66×106個/mL、氨基酸含量172.83mg/L、發(fā)酵溫度10.91℃。利用選育的酵母和最優(yōu)化的發(fā)酵條件，在1000L不銹鋼全自動錐形發(fā)酵罐中進行啤酒中試發(fā)酵，得到總高級醇含量70.67mg/L，正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇含量皆較低，感官和其它理化指標優(yōu)良的啤酒發(fā)酵液。

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Screening of Saccharomgces carlsbergensis with lower higher alcohols and pilot fermentation

ZHAO Hui1,2,LIN Shan-xi1,2,WANG Wei1,2，LING Hong-zhi1,2，PING Wen-xiang1,2,*
（1.College of Life Science，Heilongjiang University,Harbin 150080，China；2.Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology,Ministry of Education,Harbin 150500，China）

The good strain of lower higher alcohols was got by compound mutation of UV-DES with triplication screening.The fermentation conditions were optimized by using response surface analytical method and the optimization fermentation parameters were got.The beer with lower higher alcohols and good sense and physical and chemical indicators were got by pilot beer fermentation.

higher alcohols；Saccharomgces carlsbergensis；mutagenesis；response surface methodology；pilot fermentation

TS261.1+1

B

1002-0306（2011）10-0242-04

對啤酒風味影響較大的高級醇為正丙醇、異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇[1-2]，高級醇能賦予啤酒豐滿的香氣和口味[3]，并增加酒體的協(xié)調(diào)性，但過量存在也是啤酒異雜味的主要來源[4-7]，并能引起局部肝、腦損傷以及認知障礙[8-9]，啤酒中的高級醇對人體的傷害遠大于酒精，所以降低啤酒中高級醇的含量，對人們的身體健康至關(guān)重要。近年來通過酵母育種降低高級醇含量的研究主要包括：雙親滅活的原生質(zhì)體融合[10-12]、離子注入誘變[12-13]、紫外誘變[14]、激光誘變[15]、微波誘變[16-17]和基因工程技術(shù)改造[18-22]等。從實驗室保藏的卡爾酵母出發(fā)，利用紫外線和硫酸二乙酯對出發(fā)菌株進行復合誘變，根據(jù)酵母菌高級醇的合成代謝與乳酸代謝途徑之間的關(guān)系，采用乳酸培養(yǎng)基、碳酸鈣培養(yǎng)基和TTC上層培養(yǎng)基三重篩選獲得優(yōu)良菌株。同時采用響應面分析方法對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)。利用具有全夾套制冷，C.I.P自動清洗系統(tǒng)的1000L不銹鋼錐形發(fā)酵罐，進行中試啤酒發(fā)酵。

2011-06-22 *通訊聯(lián)系人

趙輝（1971-），男，博士，在站博士后，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)。

哈爾濱市科技局科技創(chuàng)新人才專項基金（2011RFQXN056）；黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究項目（12511409）。