張衛(wèi)兵，郭愛蓮，甘伯中

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研究測試中心，甘肅省干酪素工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730070）

紫外線和He-Ne激光誘變產(chǎn)植酸酶黑曲霉菌株的研究

張衛(wèi)兵，郭愛蓮，甘伯中*

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研究測試中心，甘肅省干酪素工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730070）

采用He-Ne激光(波長632nm,功率10mW)和紫外線對植酸酶產(chǎn)生菌黑曲霉Px的孢子和原生質(zhì)體進(jìn)行誘變。結(jié)果表明：原生質(zhì)體對紫外線誘變的耐受能力比孢子強(qiáng),而對He-Ne激光誘變的耐受能力比孢子弱。經(jīng)誘變后篩選出一株突變菌株L2-2，植酸酶產(chǎn)量為9274 IU/mL，是出發(fā)菌株的1.51倍，傳代實(shí)驗(yàn)表明該菌株植酸酶產(chǎn)量穩(wěn)定。

植酸酶，He-Ne激光，原生質(zhì)體，孢子

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉（Aspergillus niger Px） 本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏；菌絲生長培養(yǎng)基 蛋白胨0.3%，葡萄糖1.5%，MgSO4·7H2O 0.05%，MnSO4·7H2O 0.003%，F(xiàn)eSO4· 7H2O 0.003%，pH 5.5；斜面種子培養(yǎng)基 麩皮汁100mL，MgSO4·7H2O 0.05%，MnSO4·7H2O 0.003%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.003%，瓊脂1.5%～2%，pH5.5；再生培養(yǎng)基 酵母膏2%，葡萄糖4%，NaNO30.3%，KCl 1.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，MnSO4·7H2O 0.003%，F(xiàn)eSO4· 7H2O 0.003%，KH2PO40.01%，pH6.0，上層含0.8%瓊脂，下層含2%瓊脂，用0.6mol/L NaCl溶液進(jìn)行配制；固體篩選培養(yǎng)基 葡萄糖1.5%,植酸鈣0.1%，青霉素鈉200U/mL，MgSO4·7H2O 0.05%，MnSO4·7H2O 0.003%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.003%，瓊脂1.5%～2%，pH5.5；液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基 蛋白胨0.3%，葡萄糖1.5%，MgSO4·7H2O 0.05%，MnSO4·7H2O 0.003%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.003%，pH5.5。

He-Ne激光發(fā)生器（波長632nm,功率10mW） 西北大學(xué)光電廠；高速冷凍離心機(jī) 日本HitachiR22G；恒溫水浴搖床 HZS-H型，哈爾濱東聯(lián)電子有限公司；高壓滅菌鍋 CRDX-280型，上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；超凈工作臺 SW-CJ-1F型，蘇州蘇凈集團(tuán)；生物顯微鏡 XS-18型，上海上光集團(tuán)；三輥式壓榨機(jī) TJ-305型，國營潮州市農(nóng)機(jī)一廠；pH計 型號：PHS-3C，上海雷磁儀器有限公司；分析天平 型號：BS224S，德國塞多利斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸液的制備 黑曲霉斜面用10mL無菌水洗下,玻璃珠振蕩0.5h，將上述孢子液3000r/min離心10min，棄上清液，然后用無菌生理鹽水將所得孢子洗滌2～3次，將孢子濃度調(diào)整為106個/mL左右待用。

1.2.2 孢子的紫外誘變 將制備黑曲霉孢子懸液調(diào)整到適當(dāng)濃度，吸取9mL移入4個無菌培養(yǎng)皿中，用15W紫外燈照射，距離30cm，照射一定時間后涂布于固體篩選培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)至長出菌落，接至液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩,同時計算存活率和正變率。

1.2.3 孢子的激光誘變 將制備的黑曲霉孢子懸液調(diào)整到適當(dāng)濃度，取0.2mL置于直徑0.5cm小試管，用He-Ne激光進(jìn)行照射，輸出功率9mW，擴(kuò)束光斑直徑2.5mm，照射距離30cm，照射不同的時間，涂布于固體篩選培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)至長出菌落，接至液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩,同時計算存活率和正變率。

1.2.4 原生質(zhì)體的制備 將已培養(yǎng)好的菌絲置于離心管中，2000r/min離心15min，棄上清液。再用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌二次。稱量后，按300mg濕菌絲加1mL酶液，在一定溫度下酶解，間或振蕩，酶解時每隔0.5h取樣在顯微鏡下觀察，當(dāng)大多數(shù)細(xì)胞形成原生質(zhì)體時，停止酶解。將酶解液用滅菌的三層無菌擦鏡紙過濾后，4000r/min離心10min,收集原生質(zhì)體，用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌和穩(wěn)定，用血球計數(shù)板計數(shù)，得出原生質(zhì)體的形成數(shù)。

1.2.5 原生質(zhì)體的紫外誘變 將純化后的原生質(zhì)體用高滲液稀釋至約105個/mL的懸液，用15W紫外燈照射，距離30cm，照射不同的時間后涂布于再生培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫培養(yǎng)至長出菌落，在固體篩選培養(yǎng)基和液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基上進(jìn)行初篩和復(fù)篩,同時計算存活率和正變率。

1.2.6 原生質(zhì)體的激光誘變[13]將純化后的原生質(zhì)體用高滲液稀釋至約2.5×103個／mL，取0.2mL置于直徑0.5cm小試管，用He-Ne激光進(jìn)行照射，輸出功率9mW，擴(kuò)束光斑直徑2.5mm，照射距離30cm，照射不同的時間，涂布于再生培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫培養(yǎng)至長出菌落，在液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，同時計算存活率和正變率。

1.2.7 復(fù)篩 將誘變后的菌株培養(yǎng)至孢子成熟后，接種3環(huán)于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3d。四層紗布過濾，去除菌體，然后3000r/min離心10min，上清液為粗酶液，測其酶活，選出高產(chǎn)菌株。

1.2.8 突變株的遺傳穩(wěn)定性 在連續(xù)傳代培養(yǎng)時，由于誘變株的性狀常常不穩(wěn)定。為了檢測菌株性狀的穩(wěn)定性，將誘變選出的植酸酶活力較高的菌株在種子培養(yǎng)基上連續(xù)傳代5次，檢測酶活力。通過分析，判斷傳代次數(shù)對酶活性變化影響是否顯著。

1.3 酶活測定方法[14]

取1mL粗酶液，加入2mL植酸鈉溶液（用pH為5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液配制，濃度為8.4g/L），并搖勻，37℃保溫反應(yīng)30min，立即加入2mL顏色終止顯色液，終止并顯色，對照組先加入終止顯色液滅活后，再加入底物溶液，在415nm處測OD值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活。

植酸酶酶活定義：按上述方法，在pH5.5的條件下，每分鐘從8.4g/mL的植酸鈉溶液中釋放1nmoL無機(jī)磷所需的酶量定義為一個活力單位（IU）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用統(tǒng)計分析軟件SPSS16.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外線對孢子的誘變

紫外線對黑曲霉孢子的誘變結(jié)果見表1。

表1 不同紫外處理時間對孢子的影響

由表1可以看出,隨著照射時間的延長,孢子的存活率逐漸下降,正變率則先增加再減少，在照射420s時正變率達(dá)到最高。綜合考慮兩方面因素，照射時間選擇420s較好。

2.2 紫外線對原生質(zhì)體的誘變

紫外線對黑曲霉原生質(zhì)體的誘變結(jié)果見表2。

表2 不同紫外處理時間對原生質(zhì)體的影響

由表2可以看出，隨著照射時間的延長,孢子的存活率逐漸下降,正變率則先增加再減少，在照射60s時,正變率最高。比較表1和表2的結(jié)果,當(dāng)用UV照射60s時,孢子的存活率為46%,而原生質(zhì)體卻有50.9%，可見原生質(zhì)體對紫外線的耐受能力比孢子強(qiáng)。原因可能是由于原生質(zhì)體處在高滲溶液中接受照射，高滲溶液對它起了保護(hù)作用。另外在顯微鏡觀察中發(fā)現(xiàn),原生質(zhì)體易聚集成團(tuán),堆積成串和堆,可導(dǎo)致UV照射不均,這可能是原生質(zhì)體對UV耐受能力強(qiáng)的原因之一,至于其它可能原因,如UV對其表面結(jié)構(gòu)狀態(tài)的作用機(jī)制等有待進(jìn)一步研究。

2.3 激光對孢子的誘變

采用激光對黑曲霉孢子照射不同時間，處理結(jié)果見表3。

表3 不同激光處理時間對孢子的影響

由表3可以看出，隨著照射時間的增加，孢子的死亡率逐漸增加，正變率也隨著增大，但增加到一定程度,正變率出現(xiàn)下降趨勢,可見并非致死率越高，其正變率越高，綜合考慮以15min照射劑量為最佳。

2.4 激光對原生質(zhì)體的誘變

采用激光對黑曲霉原生質(zhì)體照射不同時間，處理結(jié)果見表4。

表4 不同激光處理時間對原生質(zhì)體的影響

由表4可以看出，隨著照射時間的增加，黑曲霉原生質(zhì)的死亡率逐漸增加，正變率也隨著增大，但增加到一定程度，正變率出現(xiàn)下降趨勢,可見并非致死率越高，其正變率越高。另外對比表3、表4可以看出，在相同劑量下，原生質(zhì)體的存活率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于孢子照射后的存活率，可見脫去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體比孢子對激光的反應(yīng)更為敏感。正變率以照射8min時為最高，所以照射時間以8min為最佳，此時具有較高的致死率和較高的正變率。

2.5 突變株篩選結(jié)果

經(jīng)紫外線和激光對原生質(zhì)體和孢子分別進(jìn)行多次誘變,從得到的突變株中篩選酶活較高的菌株，其中酶活較大的幾株見表5、表6。

表5 紫外誘變突變株的酶活

表6 激光誘變突變株的酶活

從表5可以看出，紫外誘變所選出的突變株中UV1-2、UV1-3植酸酶產(chǎn)量較高，兩株菌都是紫外線誘變孢子后篩選出的；激光誘變所選出的突變株中L2-2植酸酶產(chǎn)量最高，可達(dá)9274 IU/mL，為出發(fā)菌株的1.51倍，該菌株由原生質(zhì)體經(jīng)激光誘變后獲得。

2.6 突變株L2-2的遺傳穩(wěn)定性

將所得L2-2菌株連續(xù)傳代5代，液體搖瓶發(fā)酵后測定植酸酶產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7，方差分析結(jié)果見表8。

由表7可以看出，不同代菌株植酸酶產(chǎn)量在9270～9275 IU/mL之間，可見該菌株的酶活變化不大。另外通過方差分析（表8）可知,其組間差異的P值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于0.05,說明傳代次數(shù)對酶活性變化影響不顯著,表明突變株L2-2具有穩(wěn)定的遺傳性。

表7 不同代次的酶活

表8 傳代實(shí)驗(yàn)的方差分析

3 結(jié)論

3.1 采用He-Ne激光和紫外線對植酸酶產(chǎn)生菌Px的孢子和原生質(zhì)體進(jìn)行多次誘變，選育出一株高產(chǎn)突變株L2-2,植酸酶產(chǎn)量為9274 IU/mL，是出發(fā)菌株的1.51倍。

3.2 原生質(zhì)體對紫外線誘變的耐受能力比孢子強(qiáng)，而對He-Ne激光誘變的耐受能力比孢子弱。

3.3 對突變株L2-2進(jìn)行傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，經(jīng)傳代后，突變株植酸酶產(chǎn)量穩(wěn)定，遺傳性穩(wěn)定性好。

[1]張鐵鷹，羅士津.植酸酶在生長豬中的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].飼料與畜牧，2010（4）:47-52.

[2]于炎湖.植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用及植酸酶在飼料中的應(yīng)用[J].糧食與飼料工業(yè),1999（2）:25-27.

[3]Nagashima T,Tange T.Dephosphorytation of phytate by using the Aspergillus niger phytase with a high affinity for phytate[J]. Appl Eviro Microbial,1999,65（10）:4682-4684.

[4]石楊紅,郭艷麗,李發(fā)弟,等.葡萄糖酸鈉和植酸酶對肉雞營養(yǎng)利用和屠宰性能的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,44（1）:44-48.

[5]孟婕,郝正里,魏時來,等.不同植酸酶添加水平對肉仔雞生產(chǎn)性能的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,42（2）:1-7.

[6]蔡景義,付雪梅,王之盛,等.生長豬添加植酸酶對植物性蛋白飼料磷消化率的影響研究[J].中國飼料,2009（6）:26-28.

[7]王衛(wèi)衛(wèi),任鵬康,閆明,等.He-Ne激光對γ-亞麻酸產(chǎn)生菌少根根霉的誘變作用[J].光子學(xué)報,2002,31（2）:157-161.

[8]向洋.激光生物學(xué)[M].長沙：湖南科技出版社，1995:73-226.

[9]朱宏莉,郭愛蓮,宋紀(jì)蓉,等.氦-氖激光誘變細(xì)菌細(xì)胞及原生質(zhì)體選育果膠酶高產(chǎn)菌株[J].光子學(xué)報，2005，34（11）:1693-1696.

[10]杜海英,于宏偉,韓軍,等.原生質(zhì)體誘變選育乳糖酶高產(chǎn)菌株[J].微生物學(xué)通報，2006，33（6）:48-51.

[11]張衛(wèi)兵,郭愛蓮.植酸酶高產(chǎn)菌Px培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化[J].中國飼料,2005（9）:20-22.

[12]張衛(wèi)兵,甘伯中,李帆,等.一株產(chǎn)植酸酶菌株的分離及酶學(xué)性質(zhì)的初步研究[J].中國飼料,2009（9）:26-28.

[13]李平,宛曉春.復(fù)合誘變黑曲霉選育β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株[J].菌物系統(tǒng),2000,19（1）:117-121.

[14]張若寒.植酸酶活性的檢測方法[J].中國飼料,1997（5）: 30-32.

Mutation breeding of Aspergillus Niger with high phytase activity by ultra violet and He-Ne laser irradiation

ZHANG Wei-bing,GUO Ai-lian,GAN Bo-zhong*
（College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Analysis and Research Center of Gansu Agricultural University,Gansu Casein Engineering Technical Research Center Lanzhou,Lanzhou 730070，China）

The protoplasts and spores of the origin strain Px were treated by laser and UV radiation to obtain strain with high phytase activity.Mutant L2-2 was obtained，whose phytase activity was 9274 IU/mL，as 1.51 times as the original strain.A good application and exploitation perspective of this strain was shown.

phytase；He-Ne laser；protoplasts；spore

TS201.2

A

1002-0306（2011）10-0228-03

植酸磷是在植物性飼料中以植酸鹽形式存在的有機(jī)磷化合物[1]。植酸磷的利用率因動物種類的不同而不同，反芻動物瘤胃中的微生物能產(chǎn)生植酸酶，因而植酸磷的利用率較高；非反芻動物因消化道缺乏植酸酶，因而植酸磷的利用率低[2]。植酸酶能催化飼料原料中的植酸及其鹽類水解成六磷酸肌醇和磷酸等可利用成分,因此能提高植酸磷的利用率[3]。石楊紅等報道，添加植酸酶可提高肉雞的全凈膛率、腿肌率和腹脂率等[4]。孟婕等研究了不同的植酸酶添加水平對艾維茵肉仔雞的生產(chǎn)性能、骨骼發(fā)育和健康狀況的影響，結(jié)果表明，植酸酶適宜添加量為500FTU/kg[5]。蔡景義等研究結(jié)果表明，菜籽粕和棉籽粕中植酸磷消化率與植酸酶的添加量呈極顯著二次曲線關(guān)系[6]。目前存在的阻礙植酸酶發(fā)酵生產(chǎn)和應(yīng)用的因素主要有菌種的酶產(chǎn)量低、酶學(xué)性質(zhì)不適宜等。要改變這一現(xiàn)狀，關(guān)鍵在于選育優(yōu)良高效的植酸酶產(chǎn)生菌。在低功率激光中位于可見光范圍內(nèi)的He-Ne激光是在微生物誘變選育時應(yīng)用最廣泛的激光[7-8]。原生質(zhì)體失去細(xì)胞壁的保護(hù)作用，對環(huán)境、誘變劑等更為敏感，因此采用原生質(zhì)體作為誘變材料，效果往往較傳統(tǒng)方法更為理想[9-10]。前期本實(shí)驗(yàn)室從自然界篩選出了產(chǎn)植酸酶菌株黑曲霉Px,并對該菌株產(chǎn)植酸酶的條件進(jìn)行了研究[11-12]。本研究以黑曲霉Px為出發(fā)菌株,分別用He-Ne激光和紫外誘變原生質(zhì)體和孢子,以篩選高產(chǎn)菌株。

2010-09-21 *通訊聯(lián)系人

張衛(wèi)兵（1974-），男，副教授，博士研究生，研究方向：應(yīng)用微生物。

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)專項(xiàng)項(xiàng)目（GNSW-2006-14）；甘肅省科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目（0702NKDA034）。