呂劍光，宋 偉，霍貴成

（乳品科學(xué)教育部重點實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030）

牛初乳中IGF-I提取物對腸黏膜修復(fù)作用的研究

呂劍光，宋 偉，霍貴成﹡

（乳品科學(xué)教育部重點實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030）

目的：研究牛初乳中胰島素生長因子-I（IGF-I）對大鼠受損腸黏膜的修復(fù)作用。方法：應(yīng)用氨甲喋呤制備大鼠小腸炎模型，實驗設(shè)正常對照組，MTX模型對照組 （20μg/kg），牛初乳IGF-I提取物修復(fù)組 （75μg/kg），IGF-I修復(fù)組（75μg/kg）。后2組每天灌胃給藥1次，給藥時間從造模后第2d開始至實驗結(jié)束，共5d。第6d檢測大鼠血漿二氨氧化酶（DAO）活性、血漿D-乳酸水平，光鏡下觀察小腸組織病理形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果：與對照組相比，模型組大鼠血漿DAO活性和血漿D-乳酸水平明顯升高（P＜0.05），小腸損傷程度明顯高于對照組（P＜0.05），牛初乳中IGF-I提取物組和IGF-I組可降低血漿DAO活性及D-乳酸水平（P＜0.05），減輕小腸損傷程度（P＜0.05）。結(jié)論：牛初乳中IGF-I提取物能夠明顯減輕大鼠腸黏膜的損傷，同時可減輕炎細(xì)胞的浸潤，對實驗性大鼠的小腸炎具有修復(fù)作用。

牛初乳，胰島素生長因子，腸黏膜/損傷

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗動物 健康Sprague-Daw Ley（SD）大鼠（清潔級）20只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購于川北醫(yī)學(xué)院，動物購進(jìn)后在本校生命院動物房飼養(yǎng)適應(yīng)一周后投入實驗；牛初乳 胎次2～5次，榨乳時間為分娩后24h；human IGF-I Peprotech，MTX，DAO標(biāo)準(zhǔn)品，D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品 sigma。

DU800型核酸/蛋白質(zhì)分析儀 BECKMAN COULTER。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛初乳中IGF-I提取 初乳經(jīng)離心后使之脫脂，將脫脂乳凝乳后離心，取上清液即得乳清，采用強(qiáng)陽離子交換樹脂SPFF用于捕獲乳清中IGF-I，即得IGF-I提取物[4]。

1.2.2 模型建立 大鼠適應(yīng)一周后，腹膜腔內(nèi)注射MTX（20μg/kg體重），造成小腸炎[5]，傷后6d處死大鼠，進(jìn)行指標(biāo)分析。

1.2.3 分組及評定 實驗設(shè)正常對照組，MTX模型對照組，牛初乳IGF-I提取物修復(fù)組（75μg/kg）及IGFI修復(fù)組（75μg/kg），每組5只大鼠。后兩組從造模后第24h開始，按劑量腹膜腔內(nèi)注射1次/d進(jìn)行干預(yù)。

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 血漿二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)活性向潔凈試管中加入0.2mol·L-1PBS 3mL（pH7.2），辣根過氧化物酶0.1mL（4μg），鄰聯(lián)茴香胺0.1mL（500μg），血漿0.5mL，最后加尸胺0.1mL（175μg），充分混勻后置37℃水浴30min。測定波長為436nm[6]。

1.2.4.2 血漿中D-乳酸水平 以改良Brandt等方法測定血漿D-乳酸濃度[7]。

1.2.4.3 腸道組織病理學(xué)檢查 將回腸末端組織固定于中性福爾馬林溶液中，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片HE染色后光鏡下觀察組織學(xué)變化。小腸損傷程度用Park等報道的積分法評估[8]。0分為正常黏膜；1分為絨毛頂部上皮下產(chǎn)生間隙；2分為上皮下間隙擴(kuò)大；3分為上皮部分絨毛脫落；4分為絨毛脫落明顯；5分為絨毛消失；6分為隱窩組織形成梗死；7分為轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)形成梗死；8分為透壁梗死。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 實驗數(shù)據(jù)重復(fù)測定5次(n=5)，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量數(shù)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 血漿DAO活性

實驗中發(fā)現(xiàn)，腸道損傷可使血漿DAO活性明顯升高，與對照組相比，有顯著差異（P＜0.05）（見圖1）。與MTX模型組比較，牛初乳IGF-I提取物組和IGF-I組血漿中DAO活性較低（P＜0.05）。牛初乳IGF-I提取物組同IGF-I組沒有顯著差異（P＞0.05）。說明牛初乳中IGF-I提取物能改善腸黏膜的損傷，對腸黏膜的損傷有修復(fù)作用。

2.2 血漿D-乳酸水平

從本實驗結(jié)果看，MTX模型組血漿中D-乳酸水平明顯高于對照組，差異有顯著性（P＜0.05）。牛初乳IGF-I提取物組和IGF-I組明顯低于MTX模型組（P＜0.05）。牛初乳IGF-I提取物組同IGF-I組沒有顯著差異（P＞0.05）（見圖2）。說明牛初乳中IGF-I提取物能降低腸黏膜的通透性。

圖1 牛初乳IGF-I提取物對血漿DAO活性的影響

圖2 牛初乳IGF-I提取物對血漿D-乳酸水平的影響

2.3 腸黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察

圖3 大鼠腸道組織學(xué)變化（HE，×200）

由圖3光鏡檢查發(fā)現(xiàn)，對照組腸黏膜細(xì)胞排列基本整齊，結(jié)構(gòu)完整，無組織壞死、缺失及水腫。MTX模型組出現(xiàn)部分腸絨毛脫落、炎細(xì)胞浸潤。牛初乳IGFI提取物組和IGF-I組病理損傷較MTX模型組明顯減輕，黏膜缺失少見，小部分腺體不完整，炎癥細(xì)胞浸潤少。各組小腸損傷程度積分比較見圖4。

圖4 小腸黏膜病理評分

3 討論

氨甲喋呤（methotrexate，MTX）為經(jīng)典的抗葉酸類抗腫瘤藥，在殺死生長、增殖快速腫瘤細(xì)胞的同時，對正常組織細(xì)胞，尤其對胃腸道黏膜細(xì)胞有損傷，可直接抑制腸上皮細(xì)胞DNA的合成[9]。通過MTX誘導(dǎo)的鼠小腸炎模型的研究，發(fā)現(xiàn)MTX不利于腸上皮的更新，直接抑制腸上皮的更新，直接抑制腸上皮細(xì)胞DNA的合成。導(dǎo)致腸隱窩細(xì)胞有絲分裂減弱和腸絨毛縮短，直至腸隱窩形態(tài)喪失、絨毛皺縮脫落[10]。本文實驗結(jié)果表明，SD大鼠注射MTX后，大鼠糞便變稀，體重下降；大鼠黏膜廣泛缺失，腸微毛萎縮，間隙變寬，斷裂，凌亂，杯狀細(xì)胞缺失；腸上皮細(xì)胞核受損，核膜破壞，消失，線粒體腫脹；腸絨毛間質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤和消腫，呈典型腸黏膜炎癥反應(yīng)。

IGF-I在牛初乳中大量存在，是牛初乳中最重要的促生長因子。IGF-I可以明顯減輕化學(xué)藥物或缺血再灌注等原因所致的腸黏膜細(xì)胞的過度凋亡而對腸黏膜具有保護(hù)效應(yīng)[11]。本實驗結(jié)果顯示，牛初乳IGFI提取物修復(fù)組和IGF-I修復(fù)組均可顯著改善腸黏膜充血、水腫糜爛等現(xiàn)象，降低大鼠腸黏膜損傷程度。

DAO是腸黏膜細(xì)胞的標(biāo)志酶，約95%存在于哺乳動物小腸絨毛上層，是小腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)高活性的結(jié)構(gòu)酶。在其他組織中則含量少、活性低[12]。生理狀況下血漿中DAO活性很低，在腸黏膜受損時，由腸黏膜細(xì)胞釋放的DAO大量入血，使血中濃度大幅上升。因此，血漿DAO活性是反映腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性較理想的指標(biāo)。實驗結(jié)果顯示，大鼠注射MTX傷后6d仍明顯高于傷前。牛初乳IGF-I提取物修復(fù)組及IGFI修復(fù)組大鼠DAO活性均明顯低于MTX模型組，說明牛初乳IGF-I提取物修復(fù)組和IGF-I修復(fù)組對大鼠的腸黏膜損傷具有明顯的修復(fù)效果。

D-乳酸是腸道內(nèi)細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種物質(zhì)，哺乳動物組織不產(chǎn)生D-乳酸，且缺乏代謝該物質(zhì)的酶系統(tǒng)，不能代謝該物質(zhì)。在腸黏膜屏障正常時，血漿D-乳酸極低，只有當(dāng)腸黏膜屏障受破壞時，D-乳酸透過腸過腸黏膜屏障入血，使血漿D-乳酸快速升高。因此，血漿D-乳酸水平可間接反映腸黏膜屏障功能，可作為腸道黏膜損傷指標(biāo)之一。本結(jié)果顯示，大鼠注射MTX傷后6d仍明顯高于傷前。牛初乳IGF-I提取物修復(fù)組及IGF-I修復(fù)組大鼠D-乳酸水平均明顯低于MTX模型組，說明牛初乳IGF-I提取物修復(fù)組和IGFI修復(fù)組能降低腸黏膜的通透性，對大鼠的腸黏膜屏障損傷具有明顯的修復(fù)效果。

總之，使用牛初乳中IGF-I提取物能夠明顯減輕大鼠小腸組織的損傷，同時可減輕炎細(xì)胞的浸潤，對實驗性大鼠小腸炎具有修復(fù)作用。

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Effect of bovine colostrum IGF-I extraction on the recovery of intestinal mucositis

LV Jian-guang,SONG Wei,HUO Gui-cheng*
（Key Lab of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

Objective:To study the effect of bovine colostrum insulin-like growth factor-I(IGF-I)extraction on injury of the intestine in rat.Methods:Rat model of enteritis was induced by Methotrexate (MTX).The experimental animals were randomly divided into four groups:normal group，MTX model group (20μg/kg)，bovine colostrum IGF-I extraction recovery group (75μg/kg)and IGF-I recovery group (75μg/kg).The last two groups were administered in corresponding groups by gastric irrigation daily for 5 days，and the administered time had been from 2nd day to 5th day.Plasma diamine oxidase (DAO)and D-lactate level were measured，histological changes in intestinal tissue were observed under the light microscope.Results:Compared with normal group，the activity of DAO and D-lactate level were significantly increased (P＜0.05)，intestine injury was deeper than the normal group(P＜0.05).The bovine colostrum IGF-I extraction recovery group and the IGF-I recovery group could less the activity of DAO and D-lactate level(P＜0.05)，and could abate intestine injury obviously (P＜0.05). Conclusion:Bovine colostrum IGF-I extraction might reduce the damage of intestinal mucosa in rats，alleviate the infiltration of inflammatory cells，and has beneficial effect on rat enteritis.

bovine colostrum；insulin-like growth factors；intestinal mucosa/injuries

TS252.1

A

1002-0306（2011）10-0181-03

胃腸黏膜損傷在臨床上常見，嚴(yán)重的黏膜損傷不僅有大出血的潛在威脅，而且還會介導(dǎo)腸源性感染，引發(fā)全身性的病理、生理及內(nèi)臟功能紊亂。因此，如何減輕黏膜損傷，促進(jìn)損傷后再修復(fù)越來越受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，初乳中含有大量的生長促進(jìn)因子，特別是表皮生長因子（EGF）和胰島素生長因子（IGF-I）。EGF對小腸有明顯的滋養(yǎng)作用，并可以提高血及組織中Gln的濃度，加強(qiáng)Gln的攝取，從而能夠有效促進(jìn)黏膜損傷的修復(fù)[1]。IGF-I作為胃腸道的一種有效營養(yǎng)因子，能有效地促進(jìn)細(xì)胞分裂，對黏膜損傷有較好的治療效果，能夠加速腸的修復(fù)[2]。胃腸黏膜損傷后，可以引起內(nèi)臟器官功能和組織病理學(xué)的改變，血漿中二胺氧化酶（DAO）活性及血漿D-乳酸水平升高[3]。本文主要研究了初乳中IGF-I作為一種營養(yǎng)因子，其提取物對氨甲喋呤（MTX）引起大鼠腸黏膜炎后的修復(fù)效果。

2010-12-07 *通訊聯(lián)系人

呂劍光（1984-），男，碩士研究生，研究方向：乳品科學(xué)與工程。

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物乳制品理論與技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊項目（CXT007）。