霍丹群，張苗苗，秦 輝，尹猛猛，董家樂，張 良，沈才洪，張宿義，2，盧中明，2

（1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400044；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000；3.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川瀘州646000）

熒光素對中國典型香型白酒的熒光鑒別

霍丹群1，張苗苗1，秦 輝1，尹猛猛1，董家樂1，張 良2，3，沈才洪2，3，張宿義1，2，盧中明1，2

（1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400044；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000；3.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川瀘州646000）

采用熒光光譜技術(shù)與模式識別分析法建立一種快速區(qū)分白酒香型的新技術(shù)。在495nm可見光激發(fā)下分別測定6種香型白酒、熒光素及這兩種物質(zhì)作用后200～800nm之間的熒光光譜，探討了熒光素與白酒的作用機(jī)理。結(jié)合模式識別法對310～380nm和504～530nm兩個波段對應(yīng)的熒光強度值進(jìn)行分層聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）和線性判別分析（Linear Discriminant Analysis，LDA），對熒光素區(qū)分不同香型白酒的效果進(jìn)行驗證。結(jié)果表明，HCA分析能完全區(qū)分6種香型白酒，LDA分析對所有樣本均得到正確的判別，正確率為100%。因此，這種基于熒光素的熒光光譜法簡單、有效，可用于不同香型白酒的快速區(qū)分。

熒光光譜，白酒香型，熒光素，分層聚類分析，線性判別分析

白酒歷史文化悠久，是我國的特色酒類，與白蘭地、威士忌、老姆酒、伏特加、金酒并稱為世界6大蒸餾酒。其含有的醇類、酯類、酸類、醛類等微量成分是決定白酒香氣、口感和風(fēng)格的關(guān)鍵。目前，我國白酒香型主要通過香味成分含量比例的不同來區(qū)分，其檢測技術(shù)主要依賴于氣相色譜、液相色譜、質(zhì)譜等大型儀器，但因前期處理繁瑣、價格昂貴、耗時長等缺點，在白酒香味物質(zhì)的快速鑒別方面尚有不足。近幾年，隨著光譜分析方法的發(fā)展，熒光分析法因其靈敏度高、選擇性好、儀器設(shè)備簡單等優(yōu)點在白蘭地、油脂、肉類[1-3]等食品檢測方面的應(yīng)用日益廣泛。為此，本工作擬采用熒光分析法研究代表我國6種香型的品牌白酒與熒光素作用后的熒光光譜，同時結(jié)合模式識別方法對光譜310～380nm和504～530nm兩個波段對應(yīng)的熒光強度值進(jìn)行聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）和線性判別分析（Linear Discriminant Analysis，LDA），期望通過熒光分析法與模式識別相結(jié)合的方法建立不同香型白酒的光譜數(shù)據(jù)庫及白酒香型鑒別標(biāo)準(zhǔn)，為生產(chǎn)工藝過程質(zhì)量控制、未知香型白酒的鑒別及市售白酒品質(zhì)監(jiān)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熒光素 色譜純，Sigma公司；無水乙醇 色譜純，重慶川東有限公司；實驗用酒樣 如表1所示，均為市購。

表1 實驗用6種白酒的酒精度、香型和產(chǎn)地

LS-50B熒光光譜儀 美國Perkin-Elmer公司；Millipore水純化裝置（18.2mΩ·cm） 美國MILLIPORE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光素試劑的制備 準(zhǔn)確稱取0.01g熒光素置于10mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，混勻后于4℃冰箱避光保存12h后備用。

1.2.2 待測樣品的制備 移取配制好的熒光素試劑，用6種不同香型白酒配制成3.00×10-5mol/L待測溶液；用不同濃度乙醇水溶液配制成3.00×10-6mol/L待測溶液；以上樣品搖勻后避光靜置12h后待測。

1.2.3 光譜測量方法 將待測樣依次用1cm×1cm× 4cm可密封石英比色皿盛放，設(shè)定激發(fā)波長為495nm，入射和發(fā)射狹縫別為5nm，掃描速度為1000nm/min，記錄200～800nm波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜，每個待測樣做9次平行實驗，文中的熒光光譜為求平均值所得。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0軟件中的分層聚類分析和線性判別分析法在計算機(jī)上進(jìn)行。

聚類分析（HCA）是研究樣品（或指標(biāo)、變量）分類問題的一種多元統(tǒng)計分析方法。它是在變量間定義相似系數(shù)，在樣品間定義距離，它們分別代表了變量或樣品之間的相似程度。按其大小不同將關(guān)系密切的聚集為一個小類，然后逐步擴(kuò)大，直到所有的變量或樣品都聚集完畢，形成一個譜系，達(dá)到分類的目的[4]。

判別分析（LDA）是根據(jù)表明事物特點的變量值和它們所屬的類，求出判別函數(shù)，根據(jù)判別函數(shù)對未知所屬類別的事物進(jìn)行分類的一種分析方法。它根據(jù)已知的觀測分類和表明觀測量特征的變量推導(dǎo)出判別函數(shù)，并把各觀測量的自變量值回代到判別函數(shù)中，根據(jù)判別函數(shù)對觀測量所屬類別進(jìn)行判別。對比原始數(shù)據(jù)的分類和按判別函數(shù)所判的分類，給出錯分概率[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種香型白酒的熒光光譜

圖1所示為6種不同香型白酒在495nm激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜。從圖中可見，6種香型白酒除了在500nm處熒光強度值有差異外，在490～510nm波段的光譜形狀相似。桂林三花（GLSH）、董酒（DJ）、西鳳酒（XFJ）三種白酒在300～400nm處有較弱的發(fā)射峰。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，在可見光激發(fā)下，白酒的熒光光譜趨于相似，故單通過6種白酒自身的熒光光譜對其香型進(jìn)行區(qū)分相對困難。因此，實驗通過將熒光素?fù)诫s到白酒溶液中，并測定了混合體系的熒光發(fā)射光譜，目的是探索一種能區(qū)分白酒香型的新方法。

圖1 6種白酒的熒光光譜

2.2 熒光素的熒光光譜

熒光素在乙醇水溶液中的熒光光譜如圖2所示。在495nm激發(fā)波長激發(fā)下，熒光素在乙醇水溶液中的最大熒光發(fā)射峰在516nm附近。有文獻(xiàn)表明，熒光素在中性溶液或乙醇溶液中，其第一吸收譜帶在440～520nm之間，發(fā)射光譜一般在510～590nm之間，最大發(fā)射峰在515nm左右[6]。在53%、50%、45%這3個濃度條件下，隨著乙醇含量的遞減，其熒光強度在最大發(fā)射峰處依次減弱。在53%乙醇水溶液中熒光素的熒光強度最大，這可能是受乙醇和水分子締合度的影響。在53%乙醇水溶液中，乙醇分子和水分子之間形成較好的締合狀態(tài)，其氫鍵作用力占主導(dǎo)地位，乙醇分子在氫鍵作用下，形成新的分子團(tuán)，分子間的相互作用力增強，分子結(jié)構(gòu)變得剛性，有利于體系的熒光強度增大；同時締合狀態(tài)也固化了熒光素的剛性平面結(jié)構(gòu)，使得熒光量子產(chǎn)率增加，此時雖然喪失了部分未成對的電子，但總體熒光強度增大。在45%乙醇水溶液中熒光素的熒光強度較低，參考劉瑩等人的研究成果[7]，可能原因是因為乙醇-水分子之間形成了一種新的配合物，而這種新的配合物與熒光素分子碰撞后使無輻射躍遷增加，熒光光子數(shù)目銳減，導(dǎo)致熒光強度降低，發(fā)生了熒光猝滅。

圖2 熒光素在不同濃度乙醇水溶液中的發(fā)射光譜

2.3 熒光素-白酒體系的熒光光譜

上述研究表明，熒光素的熒光強度與乙醇濃度有一定聯(lián)系，但是其光譜形狀幾乎不受乙醇濃度影響。而實際研究發(fā)現(xiàn)，熒光素與不同白酒作用后的熒光強度和光譜形狀有較大區(qū)別，這歸因于酒體風(fēng)格特征及所含微量成分的差別。因此，將熒光素用于不同香型白酒的區(qū)分具有一定的可行性，期望通過白酒與熒光素作用后光譜之間的差異對其香型進(jìn)行區(qū)分鑒別。

圖3是鳳香型白酒（XFJ）、米香型白酒（GLSH）、濃香型白酒（LZTQ）、清香型白酒（FJ）、董香型白酒（DJ）、醬香型白酒（LJ）分別與熒光素作用后的熒光光譜。其中濃、醬、清、米這四大香型是我國白酒的基本香型，董香和鳳香為白酒的衍生香型。由圖3可見，這幾種白酒在495nm左右都存在強烈的散射峰，這主要是容器表面散射、背景散射、白酒體系散射[8-9]共同作用的結(jié)果。此外，在最大發(fā)射峰處，西鳳酒的相對熒光強度最強，郎酒最弱。研究發(fā)現(xiàn)，熒光強度與白酒含醇類、酸類、醛類等微量成分種類及量比存在密切關(guān)系。西鳳酒含有高于清香型和濃香型白酒的異戊醇及丙酸羥胺、乙酸羥胺等自身特征香氣成分[10]。異戊醇的羥基連在亞甲基上，受到水分子形成的氫鍵影響，使得羥基上電子受到的縛束較弱，易于轉(zhuǎn)移到熒光素的共軛π鍵結(jié)構(gòu)上，在可見光激發(fā)下，其熒光強度增強；而丙酸羥胺、乙酸羥胺分子結(jié)構(gòu)中的羧基基團(tuán)與熒光素分子中羥基基團(tuán)作用后生成含有羥胺基的熒光素衍生物，使得分子基態(tài)激發(fā)能降低，體系熒光強度增大。郎酒酸含量高，醛酮類含量大（特別是糠醛含量為所有白酒之冠，異戊醛、苯甲醛、丁二酮、3-羥基丁酮含量也高），含氮化合物為各香型白酒之最（以四甲基吡嗪、三甲基吡嗪最為突出）[10]。而酸類、醛類、酮類物質(zhì)會影響熒光素物質(zhì)的剛性結(jié)構(gòu)，使其形成內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生位阻效應(yīng)，導(dǎo)致熒光強度降低。在300～400nm波段，董酒與其他白酒發(fā)射峰有較明顯的區(qū)別，其λem1=342nm處，發(fā)射峰的熒光強度為29.08，在測定的6種酒樣中相對熒光強度最大?？赡茉蛑饕幸韵聝牲c：a.董酒屬于藥香型白酒，釀造原料中配有品種繁多的中草藥，其經(jīng)微生物分解代謝，生成新的熒光物質(zhì)，使其熒光強度增強；b.據(jù)文獻(xiàn)報道，董酒中醇類含量高達(dá)4.00～4.60g/L[11]，醇類物質(zhì)和其他眾多微量成分締合形成新的分子團(tuán),也有利于熒光強度增強。因此，董酒與其他白酒在300～400nm之間熒光強度差異可作為判斷其香型的主要依據(jù)。

圖3 熒光素與6種白酒作用后的發(fā)射光譜

2.4 6種香型白酒特征譜的HCA和LDA分析

經(jīng)過對分層聚類法中各種分析方法的比較，采用歐氏距離法對選取的樣本進(jìn)行聚類分析。從每種白酒中隨機(jī)選取3個樣本的光譜數(shù)據(jù)，截取310～380nm，504～530nm兩個波段對應(yīng)的熒光強度值進(jìn)行分析。圖4為6種白酒的分層聚類樹狀圖。從圖中可見，6種白酒在各自區(qū)分的基礎(chǔ)上，又被分為兩大類。其中西鳳酒單獨為一類，其他5種白酒歸為一類。第一類中桂林三花酒、汾酒和瀘州老窖特曲酒聚為一小類，郎酒、董酒聚為另一小類。對比圖3可知，其類別主要是根據(jù)504～530nm波段對應(yīng)的熒光強度值劃分的。

圖4 6種白酒的分層聚類分析圖

對6種白酒54個樣本310～380nm和504～530nm兩個波段對應(yīng)的熒光強度值進(jìn)行線性判別分析，表2為6種白酒的判別結(jié)果總結(jié)表。從分類結(jié)果可知，6種香型白酒能完全被區(qū)分開，正確率為100%。利用判別分析可以對光譜的區(qū)分能力進(jìn)行度量。除此之外，利用判別分析還可以根據(jù)光譜數(shù)據(jù)對未知樣本進(jìn)行類型判別，將未知樣本與已測光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，就可以確定未知樣本的種類。隨機(jī)選取1個樣本，以其余的53個樣本為“訓(xùn)練樣本”建立判別函數(shù)，然后對開始取出的1個樣本進(jìn)行判別，確定其類別，并與樣本實際類別比對。通過對53個樣本進(jìn)行上述判別分析，所有樣本均得到正確的判別，正確率為100%。目前的實驗表明，本文選取的波長范圍及熒光強度值可對6種白酒進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。

表2 判別結(jié)果總結(jié)表

3 結(jié)論

本文探討了基于熒光素的熒光光譜法區(qū)分不同香型白酒的新方法，在合適的熒光素與白酒配比反應(yīng)和熒光檢測條件下，通過分析熒光素與不同濃度乙醇水溶液和6種不同香型白酒反應(yīng)后的熒光光譜，證明了乙醇、水分子之間的締合程度（氫鍵形成）是影響體系熒光強度的一個主要因素，而白酒中微量成分的種類及其量比是影響熒光光譜的另一重要因素。在對310～380nm和504～530nm兩個光譜波段對應(yīng)的熒光強度值進(jìn)行模式識別分析（HCA、LDA）的基礎(chǔ)上，證明熒光光譜法可以有效區(qū)分不同香型的白酒。由于熒光分析相對簡單，分析操作時間短而且檢測費用低廉，可以以熒光素為基礎(chǔ)建立不同香型白酒的熒光數(shù)據(jù)庫，用于白酒香型快速鑒別。綜上所述，以熒光光譜結(jié)果為數(shù)據(jù)源，通過模式識別分析，可為白酒香型、品牌甚至年份的鑒定提供新的途徑，在生產(chǎn)工藝過程質(zhì)量控制及市售白酒品質(zhì)監(jiān)控等方面都具有重要意義。

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Fluorescent recognition of typical flavors of Chinese liquors based on fluorescein

HUO Dan-qun1，ZHANG Miao-miao1，QIN Hui1，YIN Meng-meng1，DONG Jia-le1，ZHANG Liang2，3，SHEN Cai-hong2，3，ZHANG Su-yi1，2，LU Zhong-ming1，2
（1.Bioengineering College of Chongqing University,Chongqing 400044,China；2.Luzhoulaojiao Group Co.Ltd.,Luzhou 646000,China；3.Liquor Making Biological Technology and Application of Key Laboratory of Sichuan Province,Luzhou 646000,China）

The fluorescent spectrometry based on fluorescein combined with pattern recognition analysis was used for fast flavors discrimination in Chinese liquors.The fluorescence spectra between 200nm to 800nm of six different flavors Chinese liquors were scanned with the visible light excited at 495nm；also，the fluorescence spectra of fluorescein and the fluorescence spectra of the six different flavors liquors reacted with fluorescein were detected in the same condition.The reacted mechanism for fluorescein and liquors were discussed. Hierarchical Cluster Analysis (HCA)and Linear Discriminant Analysis (LDA)were used for analyzing the fluorescence intensity of two wavelength range from 310～380nm and 504～530nm to test the effect of fluorescein distinguish different flavors liquors.Analytical results indicated that the six flavors Chinese liquors could be effetely distinguished by HCA，and all simples were correctly matched in LDA with a correct rate of 100%.The study demonstrated that the fluorescent spectrometry based on fluorescein would be a simple and effective approach for typical flavors distinguishing of Chinese liquors.

fluorescence spectrum；flavors of Chinese liquors；fluorescein；hierarchical cluster analysis；linear discriminant analysis

TS262.3

A

1002-0306（2011）10-0117-04

2010-10-26

霍丹群（1965-），女，博士生導(dǎo)師，教授,研究方向：生物大分子、生物芯片、納米材料與檢測技術(shù)。

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費（CDJXS102300）；重慶市科委攻關(guān)項目（2008AC7037）；重慶大學(xué)研究生創(chuàng)新團(tuán)隊（200909B1008）；瀘州老窖股份有限公司合作研究基金項目（0221002605033）；釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室。