李寶坤，田豐偉，劉小鳴，趙建新，張 灝，宋元達(dá)，陳 衛(wèi)，*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122; 2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000)

冷凍干燥對(duì)乳酸菌代謝活力的影響

李寶坤1，2，田豐偉1，劉小鳴1，趙建新1，張 灝1，宋元達(dá)1，陳 衛(wèi)1，*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122; 2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000)

以保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌ST-Ⅲ為研究對(duì)象，用15%蔗糖、10%海藻糖、15%蔗糖+2%谷氨酸鈉及10%脫脂乳為冷凍保護(hù)劑，與不加冷凍保護(hù)劑的樣品進(jìn)行凍干后菌種活力的對(duì)比，測(cè)定冷凍干燥后菌體中己糖激酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶的活力，胞外蛋白及胞內(nèi)Ca2+的濃度變化。結(jié)果表明:冷凍干燥對(duì)菌體的己糖激酶和丙酮酸激酶影響不顯著，對(duì)乳酸脫氫酶具有顯著性的影響。同時(shí)，不加保護(hù)劑菌體的胞外蛋白含量明顯高于添加保護(hù)劑的，而胞內(nèi)Ca2+卻遠(yuǎn)低于其他組。這一結(jié)果說明，冷凍干燥使代謝關(guān)鍵酶如乳酸脫氫酶失活，同時(shí)對(duì)細(xì)胞膜造成了損傷，從而引起細(xì)胞代謝活力的下降。

冷凍干燥，乳酸菌，保護(hù)劑，乳酸脫氫酶，膜損傷

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌 ST-Ⅲ(Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ)和保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)由江南大學(xué)食品學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供;培養(yǎng)基 MRS;Fluo3-AM鈣離子熒光探針 碧云天生物技術(shù)研究所;考馬斯亮藍(lán)G-250 美國(guó)Amresco公司;己糖激酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶試劑盒南京建成生物公司;保護(hù)劑 15%蔗糖(w/v)、10%海藻糖(w/v)、15%蔗糖+2%谷氨酸鈉(w/v)、10%脫脂乳(w/v);其他試劑 均為分析純。

島津 2450紫外-可見光分光光度計(jì)，日立F-7000熒光分光光度計(jì)，LABCONCO冷凍干燥機(jī)。

1.2 凍干后存活率的測(cè)定

利用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)以15%蔗糖，10%海藻糖，15%蔗糖+2%谷氨酸鈉及10%脫脂乳作為冷凍保護(hù)劑與不加冷凍保護(hù)劑凍干前后菌體數(shù)量，將凍干后的菌粉用PBS復(fù)水至凍干前相同體積，采用MRS倒平板法，37℃(植物乳桿菌)或42℃(保加利亞乳桿菌)下培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行。根據(jù)NA/NB×100%計(jì)算存活率，NA是凍干后細(xì)胞數(shù)，NB為凍干前細(xì)胞數(shù)。

1.3 無細(xì)胞提取液制備

將凍干前后的菌液離心，用0.85%NaCl溶液清洗2次后，再用等量的磷酸鹽緩沖液(0.2mol磷酸鉀，2mmol EDTA，pH7.0)懸浮。取3mL細(xì)胞液在冰浴中進(jìn)行3s∶9s的超聲破碎100個(gè)循環(huán)。在4℃，10000 ×g離心10min，取上清液保存，用于相關(guān)酶活檢測(cè)。

1.4 己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)的測(cè)定

采用南京建成生物公司的相應(yīng)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.5 細(xì)胞內(nèi)Ca2+測(cè)定采用Fluo3－AM熒光探針法

取5mmol/L的Fluo3-AM/DMSO溶液0.6μL，加入到復(fù)水后的 3mL菌液中(1.0×109cfu/mL)，F(xiàn)luo3-AM的終濃度為1μmol/L，避光條件下，37℃孵育30min，然后離心(10000×g，5min)棄上清液，用生理鹽水洗滌一次后，重懸于3mL生理鹽水中。將負(fù)載好的樣品置于熒光分光光度計(jì)內(nèi)，以488nm為激發(fā)波長(zhǎng)，觀察525nm處的熒光強(qiáng)度。

1.6 蛋白質(zhì)的測(cè)定

考馬斯亮藍(lán)染色法［9］。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin7.5作圖，采用One-way ANOVA法統(tǒng)計(jì)分析其顯著性，P值小于0.05為顯著水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同保護(hù)劑對(duì)乳酸菌冷凍干燥存活率的影響

冷凍干燥是一個(gè)劇烈的、綜合的脅迫過程，涉及到冷凍脅迫、冰晶引起的機(jī)械損傷、高滲脅迫、脫水干燥等，導(dǎo)致菌體的存活率降低。為了提高菌體的存活率、保持菌體活力，在冷凍干燥前通常會(huì)添加一些冷凍保護(hù)劑。本研究采用15%蔗糖(w/v)、10%海藻糖(w/v)、15%蔗糖+2%谷氨酸鈉(w/v)及10%脫脂乳(w/v)作為冷凍保護(hù)劑，與不加冷凍保護(hù)劑的樣品進(jìn)行凍干后菌種存活率的對(duì)比，結(jié)果見圖1。

圖1 不同保護(hù)劑對(duì)乳酸菌冷凍干燥存活率的影響

由圖1可以看出，添加保護(hù)劑可以明顯提高菌種的存活率，但也可以看出，不同的保護(hù)劑對(duì)不同菌種的保護(hù)效果是有所差異的。對(duì)植物乳桿菌ST-Ⅲ來說，最佳的保護(hù)劑為10%的海藻糖，其存活率為92.8%;而對(duì)于保加利亞乳桿菌來說，最佳的保護(hù)劑為10%的脫脂乳，其存活率為87.7%。

2.2 不同保護(hù)劑對(duì)乳酸菌冷凍干燥后己糖激酶活力的影響

己糖激酶廣泛存在于各種動(dòng)物、植物和微生物中，為EMP代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，其活性大小與乳酸菌的糖代謝速率相關(guān)，本研究測(cè)定冷凍干燥后不同保護(hù)劑對(duì)其的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同保護(hù)劑對(duì)冷凍干燥后菌體己糖激酶活力的影響

由圖2可以看出，對(duì)于植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌，雖然在不同的保護(hù)劑中己糖激酶的活力有所不同，但相對(duì)于未加保護(hù)劑的凍干菌體來說，沒有顯著性的差異。這一結(jié)果說明，凍干對(duì)己糖激酶影響不大，己糖激酶不是乳酸菌凍干損傷的主要代謝酶。

2.3 不同保護(hù)劑對(duì)乳酸菌冷凍干燥后丙酮酸激酶活力的影響

丙酮酸激酶也是EMP代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，在糖酵解系統(tǒng)里，其催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，磷酸烯醇式丙酮酸的高能磷酸鍵在催化下轉(zhuǎn)移給ADP生成ATP，反應(yīng)不可逆，丙酮酸激酶是糖酵解途徑中的限速酶之一。本研究測(cè)定冷凍干燥后不同保護(hù)劑對(duì)其影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，經(jīng)過不同的處理，冷凍干燥后，兩種乳酸菌的丙酮酸激酶的活力變化不大，說明冷凍干燥對(duì)丙酮酸激酶的影響不大，同時(shí)可以推測(cè)出，丙酮酸激酶不是乳酸菌冷凍干燥損傷的關(guān)鍵代謝酶。

2.4 不同保護(hù)劑對(duì)乳酸菌冷凍干燥后乳酸脫氫酶活力的影響

乳酸脫氫酶是乳酸菌代謝的關(guān)鍵酶，正常發(fā)酵過程中，乳酸脫氫酶催化丙酮酸還原為乳酸，它的活力大小反映了菌株的產(chǎn)酸能力。本研究分別測(cè)定了冷凍干燥后不同保護(hù)劑對(duì)其影響，結(jié)果如圖4所示。

圖3 不同保護(hù)劑對(duì)冷凍干燥后菌體丙酮酸激酶活力的影響

圖4 不同保護(hù)劑對(duì)冷凍干燥后菌體乳酸脫氫酶活力的影響注:*，P＜0.05;＊＊，P＜0.01;圖5、圖6同。

由圖4可以看出，不同的保護(hù)劑下乳酸脫氫酶的活力有顯著性的差異。對(duì)于植物乳桿菌ST-Ⅲ來說，海藻糖的保護(hù)效果具有顯著性水平(P＜0.05)，在沒有保護(hù)劑的情況下乳酸脫氫酶的活力為6.37± 0.56U/mg蛋白，而在海藻糖中為7.16±0.47U/mg;對(duì)于保加利亞乳桿菌來說，蔗糖的保護(hù)效果達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，海藻糖和脫脂乳達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，分別為 9.25±0.79、8.26±0.72、8.66± 0.65U/mg蛋白，而未加保護(hù)劑的情況下僅僅為5.1± 0.63U/mg。

2.5 不同保護(hù)劑對(duì)乳酸菌冷凍干燥后胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

本研究采用Fluo3-AM熒光探針法測(cè)定凍干后乳酸菌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，比較不同冷凍干燥保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同保護(hù)劑對(duì)冷凍干燥后菌體胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

由圖5可知，在相同的OD條件下，植物乳桿菌ST-III和保加利亞乳桿菌菌體中的Ca2+濃度有所不同，但經(jīng)過不同的凍干處理后，變化趨勢(shì)相似。在未添加保護(hù)劑時(shí)Ca2+熒光強(qiáng)度最低，在海藻糖中的Ca2+熒光強(qiáng)度最大。說明海藻糖對(duì)乳酸菌具有良好地保護(hù)效果，可以很好地保護(hù)膜的完整性。這是因?yàn)樵诰w脫水和復(fù)水的過程中，海藻糖中羥基可以和磷脂雙分子層形成氫鍵，保持了膜的穩(wěn)定性［10］，從而減少了胞內(nèi)Ca2+的流失。

2.6 不同保護(hù)劑對(duì)乳酸菌冷凍干燥后胞外蛋白濃度的影響

因脫脂乳中含有較多蛋白質(zhì)，所以導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏大，影響觀測(cè)結(jié)果，在此將其略去，測(cè)定結(jié)果見圖6。

圖6 凍干后胞外蛋白的含量

由圖6可知，未添加保護(hù)劑的菌體凍干后，菌液胞外蛋白含量比添加保護(hù)劑組的要高，說明在未添加冷凍保護(hù)劑的情況下，凍干會(huì)導(dǎo)致菌體的細(xì)胞膜破損，細(xì)胞膜通透性增大，胞內(nèi)蛋白溶出細(xì)胞外，保護(hù)劑在保護(hù)細(xì)胞膜完整性上起到很重要的作用。

3 結(jié)論

在冷凍干燥的過程中，保護(hù)劑對(duì)不同菌種的保護(hù)效果不同，對(duì)植物乳桿菌ST-Ⅲ來說，最佳的保護(hù)劑為10%的海藻糖，其存活率為92.8%，而對(duì)于保加利亞乳桿菌來說，最佳的保護(hù)劑為10%的脫脂乳，其存活率為87.7%。冷凍干燥對(duì)菌體的己糖激酶和丙酮酸激酶影響不顯著，對(duì)乳酸脫氫酶具有顯著性的影響，其中以海藻糖的保護(hù)效果最好。這一結(jié)果說明在冷凍干燥的過程中乳酸脫氫酶與菌體的活力相關(guān)。同時(shí)還測(cè)定了凍干后菌體胞外蛋白及胞內(nèi)Ca2+的濃度變化，研究發(fā)現(xiàn)，不加保護(hù)劑菌體的胞外蛋白含量明顯高于添加保護(hù)劑的，而胞內(nèi)Ca2+卻遠(yuǎn)低于其他組，說明冷凍干燥過程對(duì)細(xì)胞膜造成了損傷，從而引起細(xì)胞代謝活力的下降。

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Effect of freeze drying on the metabolic viability of lactic acid bacteria

LI Bao-kun1，2，TIAN Feng-wei1，LIU Xiao-ming1，ZHAO Jian-xin1，ZHANG Hao1，SONG Yuan-da1，CHEN Wei1，*
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.School of Food，Shihezi University，Shihezi 832000，China)

The survival rates of Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ and Lactobacillus bulgaricus in the presence of cryoprotectants such as 15%sucrose，10%trehalose，15%sucrose+2%sodium glutamate and 10%reconstituted skim milk(RSM)were estimated.In addition，we determined the activities of hexokinase(HK)，pyruvate kinase (PK)，lactate dehydrogenase(LDH)，extracellular proteins was higher and intercellular Ca2+immediately following the freeze-drying.The results showed that the differences in HK and PK activities with and without the cryoprotectants during freeze-drying were not significant，but activities of LDH were significantly different prior to and after freeze-drying.Meanwhile，the results showed extracellular proteins was higher and intercellular Ca2+was lower in absence of cryoprotectants than in the presence of cryoprotectants.These results suggested that freezedying inactivated key enzymes(LDH)and damaged membrane structure and function.These led to decrease in viability of lactic acid bacteria during freeze-drying.

freeze-drying;lactic acid bacteria;cryoprotectants;lactate dehydrogenase;damage of membrane

TS201.3

A

1002-0306(2011)09-0203-04

乳酸菌(LAB)是一類重要的微生物，在食品工業(yè)上常常用做發(fā)酵劑及益生菌制品。工業(yè)上使用的乳酸菌依賴其濃度及保藏技術(shù)，要求其在長(zhǎng)期保藏的過程中能保持活力及其功能［1］。冷凍干燥保藏是制備高效發(fā)酵劑常用的技術(shù)手段之一，其主要步驟為先把物質(zhì)中的水分，主要是游離水預(yù)先進(jìn)行降溫凍結(jié)成固態(tài)的冰，然后在真空的條件下使物質(zhì)中的冰晶升華，待冰晶升華后再除去部分吸附水，而物質(zhì)本身留在凍結(jié)時(shí)的冰態(tài)固架中，因此其干燥后體積不變，疏松多孔，最終得到殘水量很少(1%～4%)的干制品［2］。冷凍干燥技術(shù)是眾多菌種保藏方法中最理想的方法之一，但是凍干過程不可避免地會(huì)造成部分乳酸菌損傷，甚至死亡［3］。多年以來，針對(duì)冷凍干燥帶來乳酸菌活力低下的問題，國(guó)內(nèi)外開展了大量的研究工作。在乳酸菌冷凍干燥方面，深入研究乳酸菌在冷凍干燥過程中的微生物學(xué)性質(zhì)和存活機(jī)理，結(jié)合添加冷凍干燥保護(hù)劑［4-6］、乳酸菌生長(zhǎng)培養(yǎng)控制［7］、細(xì)胞生理狀態(tài)調(diào)控［8］和冷凍干燥工藝參數(shù)選擇等多種手段，以提高凍干乳酸菌的活力，一直是乳酸菌冷凍干燥研究的重點(diǎn)。本文以植物乳桿菌ST-Ⅲ(Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ)和保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)為研究對(duì)象，檢測(cè)不同保護(hù)劑中冷凍干燥后菌體存活率及凍干對(duì)糖代謝關(guān)鍵酶的影響，分析冷凍干燥造成菌體失活的主要因素，為乳酸菌冷凍干燥提供理論支持。

2010-05-16 *通訊聯(lián)系人

李寶坤(1979-)，男，教師，在讀博士研究生，研究方向:食品微生物學(xué)。

國(guó)家自然基金(20836003，30871952);“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2009BADC1B02，2009BADB9B05)。