吳共發(fā)張 彥薛小磊趙海燕何 楠韓慧霞＊

(1南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院病理科;2南方醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學系,廣州 510515)

四種防脫載玻片使用效果的比較

吳共發(fā)1,2張 彥2薛小磊2趙海燕2何 楠2韓慧霞1,2＊

(1南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院病理科;2南方醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學系,廣州 510515)

免疫組織化學; 脫片

免疫組織化學實驗中,由于切片要在試劑中長時間浸泡,尤其是經(jīng)過微波或高壓加熱抗原修復(fù)處理等操作,極易造成脫片而影響實驗進程,這就要求實驗前對載玻片進行防脫片處理。本研究旨在從多種硅化方法中探討一種操作簡便,防脫效果好的免疫組織化學實驗防脫片處理方法。

材料和方法

1.材料

高品質(zhì)普通載玻片,3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-AMINOPROPYL TRIETHOXY-SILANE,APES)試劑,為美國 Sigma公司產(chǎn)品;各種濃縮型單克隆抗體、即用型二步法免疫組化廣譜檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;組織防脫載玻片,購自江蘇海門神鷹實驗器材廠。

2.方法

2.1 硅化玻片方法 載玻片浸入重鉻酸鉀硫酸清潔劑過夜,自來水沖洗干凈,去離子水過3遍后烤干,進行如下硅化處理。方法Ⅰ:1:50APES無水丙酮液浸泡載玻片約60s,后用無水丙酮浸泡載玻片約60s,最后蒸餾水浸洗1min,通風處晾干裝盒備用。方法Ⅱ:1:50APES無水乙醇液浸泡載玻片約60s,后用無水乙醇浸泡載玻片約60s,最后蒸餾水浸洗 1min,通風處晾干裝盒備用。方法 Ⅲ:1:50APES蒸餾水溶液浸泡載玻片約60s,蒸餾水浸洗1min,通風處晾干裝盒備用。

2.2 免疫組織化學方法及分組 采用SP二步法。所有組織來自南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院病理科2005年1月至2010年5月的存檔的蠟塊,包括大腸正常組織、大腸癌組織及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織、胃癌組織及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織、食管癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織、子宮頸癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織。所有組織均為10%中性甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋3μm厚切片,所有切片烤片過夜。實驗分4組。分組1:所用防脫載玻片全部經(jīng)方法Ⅰ硅化,共411張載玻片,檢測指標為 Tiam1,CK,E-cadherin,vimentin。分組2:所用防脫載玻片全部經(jīng)方法Ⅱ硅化,共137張載玻片,檢測指標為Snai1。分組3:所用防脫載玻片全部經(jīng)方法Ⅲ硅化,共235張載玻片,檢測指標為E-cadherin,vimentin,MMP-2。分組4:所用組織防脫載玻片購自江蘇海門神鷹實驗器材廠,共137張,檢測指標為 E-cadherin,vimentin,MMP-2。按所用一抗要求均用高壓加熱進行抗原修復(fù)處理,修復(fù)過程為:檸檬酸鹽或EDTA修復(fù)液高壓鍋加熱至沸騰,放入切片,噴氣后持續(xù)加熱3min,噴氣開始時電磁爐從2000w調(diào)為1000w,室溫冷卻20分鐘。

3.統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理,采用 Kruskal-Wallis檢驗比較4個分組的脫片情況,雙側(cè) P<0.05具有統(tǒng)計學差異。

結(jié) 果

分組1、分組2及分組3出現(xiàn)不同程度部分脫片但均未出現(xiàn)全脫片現(xiàn)象;分組4出現(xiàn)一張脫片,脫片面積小于10%,未出現(xiàn)全脫片現(xiàn)象(表1),統(tǒng)計學分析顯示4個分組間脫片情況無顯著差異(χ2=3.883,Ρ=0.274),4種防脫玻片的防脫片效果無顯著性差異,防脫效果基本相同。

表1 防脫片效果比較Table1 comparisons of effect on prerenting slices escape from glass slide

討 論

在免疫組織化學實驗中,實驗的成敗與是否脫片密切相關(guān)。實踐證明,免疫組化組織脫落,受許多因素影響,如載玻片清潔、防脫片劑包被、蠟塊選擇、切片厚薄、烤片適度、抗原修復(fù)等[1]。由于本實驗室研究需要,經(jīng)常進行免疫組化實驗,在實驗過程中發(fā)覺假如載玻片防脫片效果不好會極易造成脫片而嚴重影響實驗進程,因此載玻片必須經(jīng)過涂膠或硅化處理,使組織切片牢固地貼在載玻片上。各個實驗室間一般多采用不同的黏附劑,目前通用的是多聚賴氨酸(Poly-lysine)或硅化片(APES),都具有極好的防脫片效果[2]。經(jīng)過本實驗室人員大量應(yīng)用,我們認為APES硅化玻片脫片現(xiàn)象非常少,防脫效果比多聚賴氨酸好[3],操作簡便,經(jīng)過APES處理的載玻片基本看不出痕跡。硅化玻片的APES試劑可以用丙酮、無水乙醇或蒸餾水稀釋,但前兩種方法玻片硅化后還需經(jīng)過丙酮或無水乙醇及蒸餾水洗兩個步驟,而且稍洗不干凈,玻片就會出現(xiàn)斑點狀白色沉淀,相比之下,用蒸餾水稀釋APES硅化載玻片,省去丙酮或無水乙醇浸洗步驟,還節(jié)省去丙酮或無水乙醇等試劑,也不會出現(xiàn)白色斑點狀沉淀[3]。本實驗也證實了此觀點。本實驗用丙酮、無水乙醇及蒸餾水三種不同液體稀釋APES,自己制備防脫載玻片,并將市售組織防脫載玻片作為對照,將這些載玻片應(yīng)用于大量免疫組化實驗。通過實踐應(yīng)用后比較并經(jīng)統(tǒng)計軟件分析顯示,4種防脫載玻片防脫片效果無顯著性差異(P>0.05),即4種防脫載玻片防脫片效果基本相同。但單從表面數(shù)據(jù)看,本實驗所用市售組織防脫載玻片防脫效果似乎更佳。

綜上所述,在經(jīng)濟條件允許情況下,購買高品質(zhì)的市售組織防脫載玻片用于免疫組化實驗,是一種方便快捷且效果極佳的方法。如果自己制備防脫載玻片,我們建議首選APES蒸餾水溶液硅化處理玻片即本文方法Ⅲ,此法與APES丙酮液或APES無水乙醇液硅化玻片比較,步驟更簡單,更省成本且防脫效果不亞于它們,確實是一種值得推廣的方法。

[1]林蓁,田甜.免疫組化染色防止脫片幾點改進.實用癌癥雜志,2010,25(1):73-75

[2]王小亞.免疫組織化學標準化(一).診斷病理學雜志,2008,15(1):80-81

[3]張威,駱新蘭,梁英杰.制備硅化玻片技術(shù)方法的改進.中華病理學雜志,2008,31(4):362

R-331

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.021

2010-12-10

2011-01-10

吳共發(fā),男(1982年),漢族,碩士研究生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)