李 勇

（廣東藥學院藥物研究所/廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州510006）

正交試驗法優(yōu)選消渴降糖顆粒的提取工藝

李 勇

（廣東藥學院藥物研究所/廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州510006）

目的優(yōu)選消渴降糖顆粒的提取工藝。方法采用正交試驗設(shè)計，以HPLC測定人參皂苷Rg1、鹽酸小檗堿含量、總固體得率為指標優(yōu)選提取工藝條件。結(jié)果優(yōu)選人參、黃連提取工藝為以70%乙醇6倍量、提取3次，每次1.5h。結(jié)論所優(yōu)選工藝條件合理可行、穩(wěn)定，為該藥的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

消渴降糖顆粒；提取工藝；正交試驗；人參；黃連

消渴降糖顆粒由人參、黃連、地黃等藥物組成，具有益氣養(yǎng)陰、清熱潤燥，養(yǎng)血活血作用，用于治療屬氣陰兩虛、瘀熱互結(jié)之2型糖尿病。方中人參中含有皂苷類、人參多肽類等成分，具有明顯調(diào)節(jié)機體糖代謝的作用[1-4]，與胰島素合用，可減少胰島素劑量，延長降血糖作用時間。黃連中含有小檗堿、甲基黃連堿等生物堿，實驗證明小檗堿可降低正常小鼠、環(huán)氧嘧啶型糖尿病小鼠和自發(fā)性糖尿病小鼠的血糖，改善小鼠的葡萄糖耐受量、明顯改善糖尿病患者的血液流變學作用[5,6]。原工藝以水提取，在制備和使用上有諸多不便，活性成分提取率較低。本文以人參皂苷Rg1含量、鹽酸小檗堿含量為指標，采用正交試驗設(shè)計，對人參、黃連的醇提工藝條件進行了優(yōu)選。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Dionex ultimate 3000高效液相色譜儀（美國）；KQ-250型醫(yī)用超聲波清洗機（昆山超聲儀器有限公司）；LD4-2型離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海嘉鵬科技有限公司）；AE-240S型電子分析天平（瑞士METTLER）；0～100（%VOL）酒精計（河北滄州雙華儀表廠）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿（110713-200208）、人參皂苷Rg1（0703-200221），中國藥品生物制品檢定所提供；人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey的干燥根，黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch的干燥根莖，以上藥材均購自廣州致信中藥飲片有限公司，符合藥典規(guī)定；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 人參、黃連單提、合提對比

2.1.1 人參、黃連單獨提取樣品溶液的制備

2.1.2 人參、黃連復方合提樣品溶液的制備

稱取人參30g、黃連20g，置圓底燒瓶中，加70%乙醇7倍量，加70%乙醇7倍量，加熱回流2次，每次1.5h，提取液過200目濾布，合并濾液，定容至500mL，作為樣品溶液Ⅲ，備用。

2.1.3 人參皂苷Rg1含量測定

2.1.3.1 色譜條件

色譜柱：DIONEX Acclaim 120 C18（250×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.05%磷酸（19.7∶80.3）；檢測波長：203nm；柱溫：30 ℃。

2.1.3.2 對照品溶液制備

精密稱取人參皂苷Rg1對照品8.10mg，加甲醇制成每1mL含人參皂苷Rg1 0.405mg的溶液，即得。

2.1.3.3 供試品溶液制備

精密吸取樣品溶液Ⅰ、Ⅲ各50mL，水浴蒸干，殘渣加水25mL使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次25mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別作為供試品溶液Ⅰ、供試品溶液Ⅱ。

2.1.3.4 標準曲線繪制

分別精密吸取2.1.3.2項下對照品溶液0.05、0.15、0.25、0.50、0.75、1.0mL，分別置于1mL量瓶中，加甲醇稀釋到刻度，搖勻，照上述色譜條件測定，以峰面積積分值為縱坐標（Y），以人參皂苷Rg1微克數(shù)為橫坐標（X），計算回歸方程 Y＝5.9332X＋0.0192，r＝0.9999，表明人參皂苷Rg1在0.405～8.100μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.1.3.5 含量測定

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液Ⅰ、Ⅱ各20 μL注入液相色譜儀中，測定人參皂苷Rg1色譜峰面積，計算其含量（表1）。

2.1.4 鹽酸小檗堿的含量測定

2.1.4.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%十二烷基磺酸鈉磷酸溶液（52∶48）；檢測波長：265nm；柱溫：30℃。

2.1.4.2 對照品溶液制備

精密稱取鹽酸小檗堿10.80 mg，加甲醇1mL含鹽酸小檗堿0.1080mg的溶液，即得。

2.1.4.3 供試品溶液制備

精密吸取樣品溶液Ⅱ、Ⅲ各1mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別作為供試品溶液Ⅲ、供試品溶液Ⅳ。

2.1.4.4 含量測定

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液Ⅲ、Ⅳ各5μL注入液相色譜儀中，測定人參皂苷Rg1色譜峰面積，計算其含量（表1）。

2.1.4.5 標準曲線繪制

分別精密吸取2.1.4.2項下對照品溶液0.05、0.10、0.15、0.25、0.50、0.75mL，分別置于1mL量瓶中，加甲醇稀釋到刻度，搖勻，照上述色譜條件測定，以峰面積積分值為縱坐標（Y），以鹽酸小檗堿微克數(shù)為橫坐標（X），計算回歸方程 Y＝68.6700X－0.1329，r＝0.9999，表明鹽酸小檗堿在0.108～1.62μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（表1）。

表1 人參、黃連單提與合提結(jié)果比較

由表1可知，人參皂苷Rg1、鹽酸小檗堿的相對提取率均高于人參，黃連單獨提取，結(jié)合大生產(chǎn)，確定人參、黃連合提，并采用正交試驗設(shè)計進一步對人參、黃連的提取工藝條件進行優(yōu)選。

2.2 人參、黃連復方合提工藝研究[7,8]

2.2.1 正交實驗設(shè)計

以人參皂苷Rg1、鹽酸小檗堿及總固體得率為指標，采用正交試驗對影響提取效率的醇濃度、提取時間、溶劑用量、提取次數(shù)等因素進行優(yōu)選，試驗設(shè)計見表2。

表2 提取工藝因素水平表

2.2.2 數(shù)據(jù)分析

以人參皂苷Rg1、鹽酸小檗堿和總固體得率為指標考察四個因素，影響提取效率的因素依次為提取次數(shù)＞乙醇濃度＞提取時間＞加液量，較優(yōu)的工藝方案為人參、黃連以70%乙醇6倍量回流提取3次，每次1.5h，結(jié)果見表3。

2.3.3 比較驗證試驗

因提取時間在第3個水平，故進行比較驗證試驗，稱取人參30g，黃連20g，分別按表4條件進行提取，依法測定人參皂苷Rg1、鹽酸小檗堿及總固體得率，由表4可知，提取時間1.5h與2h，人參皂苷Rg1、鹽酸小檗堿均無明顯差異，且各批樣品指標成分均高于正交試驗最大值，表明優(yōu)選的工藝條件合理、可行、穩(wěn)定。

3 討 論

3.1 鹽酸小檗堿易溶于熱水和熱乙醇，而在冷水、冷乙醇中溶解度降低，故在提取后需趁熱抽濾，以減少成分損失。

3.2 在預實驗中，人參、黃連分別以水和乙醇作為提取溶劑，以人參皂苷Rg1、鹽酸小檗堿為指標考察，結(jié)果表明醇提效率較高，故選用乙醇回流提取。工藝中人參、黃連以乙醇合提，符合傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論，簡化工藝，降低了成本，而且各藥材都具有較高的提取效率，適合工業(yè)生產(chǎn)需要，驗證試驗結(jié)果表明本工藝合理可行。

表3 人參、黃連L9（34）正交試驗及結(jié)果

表4 人參、黃連合提驗證實驗結(jié)果

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