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        直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測豬肉中磺胺嘧啶

        2011-10-28 07:32:44楚金申何慶華王劉花
        食品科學(xué) 2011年10期
        關(guān)鍵詞:包被化學(xué)發(fā)光嘧啶

        楚金申,許 楊*,何慶華,王劉花,盧 江

        (食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,江西 南昌 330047)

        直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測豬肉中磺胺嘧啶

        楚金申,許 楊*,何慶華,王劉花,盧 江

        (食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,江西 南昌 330047)

        建立一種檢測豬肉中磺胺嘧啶的簡便、快速、高特異性的直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法。采用改良的過碘酸鈉法制備酶標抗體,以辣根過氧化物酶催化魯米諾-過氧化氫作為化學(xué)發(fā)光體系。經(jīng)優(yōu)化該方法檢測條件為:利用檸檬酸緩沖液稀釋抗原包被質(zhì)量濃度為0.8μg/mL,酶標抗體2000倍稀釋,競爭反應(yīng)25min;所建立的方法分析靈敏度為2.96ng/mL,批內(nèi)變異系數(shù)小于8.32%,批間變異系數(shù)小于13.4%,以豬肉為樣品的分析回收率為75.6%~103.7%,與其他結(jié)構(gòu)類似物未見明顯交叉,所建立的標準曲線相關(guān)系數(shù)為0.9922、檢測線性范圍為4.14~244ng/mL、檢測時間為25min,可在實際生產(chǎn)中應(yīng)用。

        磺胺嘧啶;直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法;辣根過氧化物酶;豬肉

        磺胺類藥物是人工合成的一類具有對氨基苯磺酰胺共同母核結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物,廣泛應(yīng)用于畜禽抗感染治療,有時也作為動物飼料添加劑促進生長[1]。該類藥物的毒副作用非常明顯,據(jù)報道它與痘瘡的發(fā)病緊密相關(guān),具有腎毒性[2],而且可以在動物體內(nèi)殘留,通過動物源性食品進入食物鏈直接威脅人類的身體健康?;前粪奏な腔前奉愃幬餁埩粑镏械湫偷囊环N[3],其分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。我國與歐盟規(guī)定動物源性食品中磺胺類藥物總量的最高殘留限量為100μg/mL[4-5]。

        圖1 磺胺嘧啶結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of sulfadiazine

        目前常用的檢測磺胺嘧啶(sulfadiazine,SD)的方法主要有高效液相色譜(high performance liquidchromatography,HPLC)法[6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatograph-mass spectrometry,GC-MS)[7]和酶聯(lián)免疫吸附法(engyme-linked immuno-sorbent assay,ELISA)[8]等。前兩種方法靈敏、準確,但耗時、費力、成本高且需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)的人員操作;酶聯(lián)免疫吸附法快速、特異性好,但靈敏度不夠高。直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法省略了間接競爭方法中加二抗的步驟,節(jié)約檢測時間,既具有放射免疫法的高靈敏度,又具有酶聯(lián)免疫法操作簡便、快速的特點,線性范圍寬、測試中無需使用對人體有害的試劑[9]。

        本研究制備抗磺胺嘧啶酶標抗體,建立直接競爭酶聯(lián)免疫分析法(direct competitive-engyme-linked immunosorbent assay,DC-ELISA),并采用魯米諾化學(xué)發(fā)光體系建立直接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法(direct competitive chemiluminescence enzyme immunoassay,DC-CLEIA)。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑與儀器

        豬肌肉 市購。

        磺胺嘧啶單克隆抗體腹水 自制;磺胺嘧啶(sulfadiazine,SD)、磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine,SM2)、磺胺對甲氧嘧啶(sulfamethoxydiazine,SMD)、磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine,SMM)、磺胺甲噁唑(s u l f a m e t h o x a z o l e,S M Z)、磺胺喹惡啉(sulfaquinoxaline,SQ)、對氨基苯甲酸(4-aminobenzoic acid,PABA)、磺胺甲二唑(sulfamethizole,SMT)、磺胺吡啶(sulphapyridine,SP)、慶大霉素(gentamicin,GTM)、氯霉素(chloramphenicol,CAP) 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;磺胺(sulfanilamide,SN)、對氨基苯磺酸(sulfanilic acid,p-ASA) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)(RZ>3)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;化學(xué)發(fā)光底物液美國Pierce公司。

        化學(xué)發(fā)光檢測儀、酶標儀 美國Thermo公司;96孔化學(xué)發(fā)光板條 深圳金燦華有限公司;Ultrospec紫外分光光度計 美國Amersham公司。

        1.2 方法

        1.2.1 抗體的純化及鑒定

        采用辛酸-硫酸銨聯(lián)合沉淀法[10]對腹水進行初步純化。采用Protein G親和層析柱進一步純化后用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定其純度,稀釋n倍,紫外分光光度計分別測定OD280nm和OD260nm,根據(jù)式(1)計算IgG含量:

        1.2.2 酶標抗體的制備

        采用改良的過碘酸鈉法[11]將HRP與已純化的單抗相連制備酶標抗體IgG-HRP。用紫外分光光度計分別測定OD403nm和OD280nm,根據(jù)公式計算酶量、抗體量和克分子比:

        1.2.3 直接競爭酶聯(lián)免疫分析法(DC-ELISA)

        用0.05mol/mL磷酸緩沖液稀釋檢測抗原(SD-OVA)至1.2μg/mL,向微孔板中每孔加100μL,4℃過夜包被,PBST洗滌液洗3次,每孔加300μL封閉液(5%的脫脂牛奶),37℃封閉1h后,甩去封閉液洗滌3次,在吸水紙上拍干,每孔中分別加入SD標準品或樣品50μL,酶標抗體溶液50μL,混勻,37℃溫育35min,洗滌4次,拍干,加100μL TMB顯色液,顯色反應(yīng)5min后加 2mol/L硫酸50μL終止反應(yīng),并于450nm波長處檢測光密度(OD450nm)。未加SD標準品孔的OD450nm值為B0,添加了SD標準品孔的OD450nm值為B,按式(2)計算結(jié)合率,結(jié)合率為50%時所對應(yīng)的SD標準品質(zhì)量濃度即是IC50。

        1.2.4 直接競爭化學(xué)發(fā)光免疫法(DC-CLEIA)

        用0.06mol/mL檸檬酸緩沖液稀釋檢測抗原(SD-OVA)至0.8μg/mL向微孔板中每孔加100μL,4℃過夜包被,然后用PBST洗滌液洗3次,每孔加300μL封閉液(5%的脫脂牛奶),37℃封閉1h后,甩棄封閉液洗滌3次,在吸水紙上拍干,每孔中加入SD標準品或樣品50μL,酶標抗體溶液50μL,混勻,37℃溫育25min,洗滌4次,拍干,每孔加發(fā)光底物液100μL,用化學(xué)發(fā)光檢測儀測量相對發(fā)光強度單位(relative light units,RLU)。未加SD標準品孔的RLU值為B0,添加了SD標準品孔的RLU值為B,IC50的計算同1.2.3節(jié)。

        1.2.5 檢測條件的確定

        采用方陣滴定[12]確定DC-ELISA抗原和抗體反應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

        文獻[13]表明,RLUmax/IC50越大,DC-CLEIA的靈敏度和重復(fù)性越好,因此引入RLUmax/IC50評價各種因素的影響。按照1.2.4節(jié)方法分別對抗原包被液及包被質(zhì)量濃度、酶標抗體稀釋倍數(shù)和競爭反應(yīng)時間優(yōu)化。

        1.2.6 樣品提取

        參照國家標準[15]。HPLC方法的樣品提取參照測定標準[14]。

        1.2.7 方法學(xué)分析

        標準曲線:稱取4mg SD標準品溶于1mL 蒸餾水配制成4mg/mL SD標準品母液,將SD標準品母液分別稀釋至終質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100、200、500ng/mL,參照文獻[12]的方法建立DC-ELISA標準曲線,參照文獻[13]的方法建立DC-CLEIA 標準曲線。將SD標準品母液分別稀釋至終質(zhì)量濃度為10、25、50、100、200、400、800、2000、4000ng/mL,參照文獻[14]用HPLC分別測定計算峰面積,并建立HPLC標準曲線。

        靈敏度:對零標準點平行測定10次,計算發(fā)光或OD450nm平均值及其標準偏差,再由平均值減去兩倍標準偏差后的值代入校準曲線所求得的質(zhì)量濃度即是靈敏度,重復(fù)實驗3次,計算平均靈敏度。HPLC方法的靈敏度為以色譜峰面積響應(yīng)值等于3倍信噪比的進樣量計算,求出靈敏度。

        批內(nèi)批間變異:隨機抽取板條分別進行3個批次的包被,每批次6個平行進行測定,分別計算IC50的批內(nèi)及批間變異。

        回收率:在經(jīng)HPLC檢測為陰性豬肉樣品中分別添加 40、80、120μg/kg的SD標準品,依照1.2.6節(jié)進行樣品提取,分別用DC-ELISA和DC-CLEIA檢測樣品質(zhì)量濃度。

        特異性:本研究選取與SD結(jié)構(gòu)類似的6種磺胺類藥物和其他兩種常見的獸藥——磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺對甲氧嘧啶(SMD)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺喹惡啉(SQ)、對氨基苯甲酸(PABA)、氯霉素(CAP)和慶大霉素(GTM),采用DC-ELISA與DCCLEIA兩種方法分別測定與SD的交叉反應(yīng)率,交叉反應(yīng)率按式(3)計算:

        2 結(jié)果與分析

        2.1 抗體的純化與鑒定

        圖2 抗體純化SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of purified anti-SD McAb

        腹水經(jīng)純化后通過SDS-PAGE檢測純度,結(jié)果如圖2所示。未純化的抗體雜蛋白帶較多,使用辛酸-硫酸銨沉淀法提取純化的抗體仍然有一些雜質(zhì)蛋白,而經(jīng)過Protein G親和層析柱純化的抗體IgG有兩條清晰的條帶:一條為輕鏈,約25kD;另一條為重鏈,約50kD,純度較好。

        2.2 酶標抗體的制備

        采用改良的過碘酸鈉法將制備好的單抗和HRP連接制備酶標抗體IgG-HRP,調(diào)整HRP/IgG物質(zhì)的量投料比為1:1、2:1、4:1獲得3組酶標抗體,經(jīng)計算得它們的HRP/IgG克分子比分別為1.04、1.22、0.84,它們的效價如圖3所示。

        圖3 不同HRP/IgG物質(zhì)的量投料比酶標抗體的效價Fig.3 The titers of IgG-HRP at different HRP/IgG molecular ratios

        由圖3可知,HRP/IgG物質(zhì)的量投料比為2:1時效價最高,達到1:25600以上。

        2.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析法的建立

        2.3.1 抗原包被液的選擇

        分別使用磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液及碳酸緩沖液稀釋抗原至0.8μg/mL進行包被,其他步驟參照1.2.4節(jié),實驗結(jié)果如圖4所示。經(jīng)計算用3種緩沖液包被時IC50分別為53.5、36.6、37.8ng/mL,可見,檸檬酸緩沖液包被時,標準品競爭抑制效果最好,因此選擇檸檬酸緩沖液作為包被緩沖液。

        圖4 抗原稀釋液的選擇Fig.4 Screening of optimum dilution buffer for coating antibody

        2.3.2 抗原包被質(zhì)量濃度的選擇

        采用檸檬酸緩沖液分別稀釋抗原至1.2、1.0、0.8、0.6μg/mL,其他步驟參照1.2.4節(jié),結(jié)果如圖5所示。IC50隨著抗原包被質(zhì)量濃度的增大而增大,RLUmax/IC50隨著抗原質(zhì)量濃度的增大先是增大然后減小,在抗原質(zhì)量濃度為0.8μg/mL時達到最大,因此選用0.8μg/mL作為抗原包被質(zhì)量濃度。

        圖5 DC-CLEIA抗原包被質(zhì)量濃度的優(yōu)化Fig.5 Screening of optimum coating antibody concentration

        2.3.3 酶標抗體稀釋倍數(shù)的選擇

        用磷酸緩沖液將酶標抗體分別稀釋1000、1500、2000、3000倍,其他步驟參照1.2.4節(jié),結(jié)果如圖6所示。隨著酶標抗體稀釋倍數(shù)的增大,IC50逐漸減小并趨于恒定,RLUmax/IC50也逐漸減小。綜合考慮IC50與RLUmax/IC50,將酶標抗體的稀釋倍數(shù)定為2000倍。

        圖6 DC-CLEIA酶標抗體稀釋度的優(yōu)化Fig.6 Screening of optimum IgG-HRP concentration

        2.3.4 酶標抗體競爭反應(yīng)時間的選擇

        圖7 DC-CLEIA抗原包被質(zhì)量濃度的優(yōu)化Fig.7 Screening of optimum reaction time

        按照1.2.4節(jié)操作步驟分別選擇競爭反應(yīng)時間為10、15、20、25、30、35min進行實驗,結(jié)果如圖7所示。隨著溫育時間的延長,IC50呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢,RLUmax/IC50在25min時達到最大,選定25min作為競爭反應(yīng)時間。

        2.4 DC-ELISA與DC-CLEIA的方法學(xué)評價

        2.4.1 標準曲線

        采用方陣滴定法確定最佳抗原包被質(zhì)量濃度為1.2 μg/mL,酶標抗體的稀釋倍數(shù)為1:3200,建立DC-ELISA標準曲線線性回歸方程為Y=-15.1829lnX+117.31(R2=0.9982),IC50=84.21ng/mL,檢測范圍(IC20~IC80)為11.67~607.4ng/mL。

        按照1.2.7節(jié)繪制DC-CLEIA標準曲線見圖8。線性回歸方程為Y=-14.717lnX+100.94(R2=0.9922),IC50=31.87ng/mL,檢測范圍(IC20~IC80)為 4.14~244.6ng/mL。

        圖8 DC-CLEIA的標準曲線Fig.8 Standard calibration curve of the DC-CLEIA

        2.4.2 靈敏度和精密度

        按照1.2.7節(jié)計算的DC-ELISA平均靈敏度為8.41ng/mL,DC-CLEIA平均靈敏度為2.96ng/mL,較DC-ELISA提高了2.84倍。

        按照1.2.7節(jié)分別計算IC50的批內(nèi)及批間變異,結(jié)果見表1。

        表1 兩種檢測方法對SD測定的精密度(n=6)Table 1 Precision of DC-CLEIA and DC-ELISA (n=6)

        2.4.3 回收率

        1.2.7節(jié)的回收率檢測實驗結(jié)果見表2。與DC-ELISA相比,DC-CLEIA的加標回收率較高。

        表2 兩種檢測方法對SD測定的加標回收率(n=3)Table 2 Recoveries of SD from spiked blank pork (n=3)

        2.4.4 特異性實驗

        本研究選取與SD標準品結(jié)構(gòu)類似的6種磺胺類藥物和其他兩種常見的獸藥——磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺對甲氧嘧啶(SMD)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺喹惡啉(SQ)、對氨基苯甲酸(PABA)、氯霉素(CAP)和慶大霉素(GTM),采用DC-ELISA與DCCLEIA兩種方法分別測定與SD的交叉反應(yīng)率,結(jié)果(表3)未見有交叉反應(yīng)。

        表3 DC-ELISA與DC-CLEIA兩種方法的交叉反應(yīng)率Table 3 Cross-reactivities to SD analogues analyzed by DC-ELISA or DC-CLEIA

        2.5 DC-CLEIA樣品測定與HPLC的比較

        按照1.2.7節(jié)中方法進行HPLC測定發(fā)現(xiàn),在10~4000μg/kg范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,線性回歸方程為Y=0.063X-0.048,線性相關(guān)系數(shù)為0.999,靈敏度為10 μg/kg。與DC-CLEIA方法相比,線性范圍較寬,但靈敏度較大。

        分別采用DC-CLEIA和HPLC測定市場上隨機購買的26份豬肌肉樣品,兩種方法的所測結(jié)果見表4,以DC-CLEIA的測定值為X軸、HPLC測定值為Y軸作圖得相關(guān)曲線如圖9所示,線性擬合的方程為Y=0.7498X-3.788,相關(guān)系數(shù)為0.956。

        表4 DC-CLEIA和HPLC的樣品測定結(jié)果Table 4 SD concentrations in real samples analyzed by DC-ELISA and DC-CLEIA

        圖9 DC-CLEIA的測定值與HPLC測定值的相關(guān)性Fig.9 Correlation between DC-CLEIA and HPLC results

        3 結(jié) 論

        3.1 采用Protein G親和層析柱對腹水進行純化,得到純度比較高的單抗,通過改良的過碘酸鈉法制備了酶標抗體,抗體效價達到 1:25600。

        3.2 優(yōu)化了化學(xué)發(fā)光酶免疫反應(yīng)的各種條件,采用HRP催化魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系,建立了一種測定豬肉中SD化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法,方法分析靈敏度為2.96ng/mL,批內(nèi)變異系數(shù)小于8.32%,批間變異系數(shù)小于13.4%,以豬肉為樣品的分析回收率為75.6%~103.7%,與其他結(jié)構(gòu)類似物未見明顯交叉,所建立的標準曲線相關(guān)系數(shù)為0.9922,檢測線性范圍為4.14~244ng/mL,樣品檢測時間僅為25min。

        3.3 建立的DC-CLEIA與DC-ELISA相比靈敏度提高了2.84倍。采用DC-CLEIA和HPLC測定了26份市場樣品,并進行對照,兩者的線性相關(guān)系數(shù)為0.956。

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        Determination of Sulfadianzine Residues in Pork by Direct Competitive Chemiluminescence Enzyme Immunoassay

        CHU Jin-shen,XU Yang*,HE Qing-hua,WANG Liu-hua,LU Jiang
        (State Key Laboratory of Food Science and Technology, Sino-Germany Joint Research Institute, Nanchang University,Nanchang 330047, China)

        A direct competitive chemiluminescence enzyme immunoassay (DC-CLEIA) was developed to determine sulfadiazine (SD) residues in pork. Assay parameters including coating antigen (OVA-SD) and enzyme labeled antibody concentrations concentrations and reaction time were optimized to be 0.8 μg/mL, 2000-fold dilution and 25 min, respectively. The analytical sensitivity of the developed method was 2.96 ng/mL, and the intra-assay and inter-assay coefficients of variation were below 8.32% and 13.4%, respectively. The recoveries for SD in negative pork spiked at three levels ranged from 75.6% to 103.7%. The McAb had no noticeable cross-reactivity to SD analogues. The standard curve displayed good linearity over the range of 4.14 to 244 ng/mL with a correlation coefficient of 0.9922. This DC-CLEIA may be used for routine detection and monitoring of SD in pork.

        sulfadiazine;direct competitive chemiluminescence enzyme immunoassay;horseradish peroxidase;pork

        TS207.3

        A

        1002-6630(2011)10-0124-06

        2010-07-23

        江西省科技支撐計劃項目(2007BS12501);國家“863”計劃項目(2007AA10Z427)

        楚金申(1985—),男,碩士研究生,研究方向為工業(yè)微生物。E-mail:chujinshen@126.com

        *通信作者:許楊(1951—),女,教授,博士,研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail:xuyang1951@163.com

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