張 妮，肖作兵*，于海燕，朱建才，戴水平

(1.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海 200237；2.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 200233)

頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用測定櫻桃酒中的揮發(fā)性成分

張 妮1，肖作兵2,*，于海燕2，朱建才2，戴水平1

(1.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海 200237；2.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 200233)

采用頂空固相微萃取(HS-SPME)與氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)測定櫻桃酒中的揮發(fā)性成分，通過對萃取參數(shù)的優(yōu)化，建立快速、準(zhǔn)確測定櫻桃酒中香氣物質(zhì)的方法。優(yōu)化后的最佳分析條件為65μm PDMS/DVB萃取頭、萃取溫度40℃、萃取時間30min、酒精度(體積分?jǐn)?shù))12%。在此條件下測定中櫻狄墨爾櫻桃酒中的揮發(fā)性成分，共鑒定出65種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酯類是櫻桃酒中種類最多和含量最多的一類揮發(fā)性物質(zhì)。

櫻桃酒；揮發(fā)性成分；頂空固相微萃?。粴赓|(zhì)聯(lián)用

櫻桃富含多種對人體有益的營養(yǎng)成分，有“含桃”的別稱，具有很大的開發(fā)價值。目前櫻桃的貯藏保鮮技術(shù)尚不完善，造成大量鮮果積壓與腐爛，急需開發(fā)櫻桃的深加工產(chǎn)品。櫻桃酒的研究尚處于初級階段。用成熟大櫻桃釀制的櫻桃酒色澤鮮艷，呈玫瑰紅色或淡紅色，既保持了大櫻桃的果香芬芳，又具有自然發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的清柔醇厚的酯香味。

由于櫻桃酒是非蒸餾酒，含有大量難揮發(fā)的成分如糖、多元酸及多酚類物質(zhì)，直接進(jìn)樣會污染氣化室及色譜柱，因而必須選擇合適的分離技術(shù)將風(fēng)味分析物從櫻桃酒中分離出來。

常見的酒中風(fēng)味成分的分離萃取技術(shù)有液-液萃取(liquid-liquid extraction)、靜態(tài)頂空法(static headspace)、動態(tài)頂空法(dynamic headspace)、同時蒸餾萃取(aimultaneous distillation extraction)、吹掃捕集(purge and trap extraction)、固相萃取(solid-phase extraction)和固相微萃取(solid-phase micro-extraction)等[1-3]，這些方法各有利弊，其中固相微萃取技術(shù)前處理步驟少、所需樣品少、無需有機(jī)溶劑，成本低、集樣品萃取濃縮為一體、靈敏度高、重顯性好[4-5]，更為重要的是，該方法是吸取頂空瓶的上方氣體進(jìn)行進(jìn)樣分析，能最大程度地表達(dá)酒體的香氣特征，現(xiàn)已被廣泛用于葡萄酒[6]、蘋果酒[4]、黃酒[7]、白酒[8]以及白蘭地[9]等各類酒的揮發(fā)性成分的研究。

櫻桃酒中的香氣成分反映了櫻桃酒的質(zhì)量和生產(chǎn)工藝，對其進(jìn)行分析檢測可指導(dǎo)櫻桃酒的生產(chǎn)過程控制，對于提高櫻桃酒的風(fēng)味質(zhì)量具有重要意義。然而目前國內(nèi)外對櫻桃酒揮發(fā)性成分的研究報道還甚少[10]，僅是對櫻桃中的揮發(fā)性成分有較為具體的研究[11-12]。本實驗采用頂空固相微萃取方法結(jié)合GC-MS分析櫻桃酒中的揮發(fā)性成分，分別從萃取頭材料、萃取溫度、萃取時間、酒精度和NaCl添加量等因素進(jìn)行優(yōu)化，為櫻桃酒的感官風(fēng)味評價和生產(chǎn)過程控制提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2008年中櫻狄墨爾櫻桃酒(干型，酒度(12±1)%)：大櫻桃100%原汁發(fā)酵 山東尊皇櫻桃酒業(yè)科技有限公司；NaCl(分析純) 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；100μm PDMS、65μm PDMS/DVB、75μm CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司；20mL頂空瓶。

1.3 測定方法

參照相關(guān)文獻(xiàn)[13]，移取5mL樣品于20mL頂空瓶中恒溫水浴，分別在不同的萃取頭材料、萃取溫度、萃取時間、酒精度和加鹽量的條件下吸附，之后將萃取頭插在氣相色譜的高溫汽化室中解吸3min，進(jìn)行GC-MS分析。質(zhì)譜結(jié)果經(jīng)WILEY譜庫檢索，僅當(dāng)匹配度大于80(最大值為100)的鑒定結(jié)果才予以報道。采用峰面積歸一化法定量計算出各揮發(fā)性成分在櫻桃酒中的相對含量。

1.4 GC-MS條件

色譜條件：毛細(xì)管色譜柱Agilent HP-INNOWax(60m×250μm，0.25μm)；手動無分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度250℃；程序升溫：初始溫度35℃，保留3min，以2℃/min的速率升至60℃，再以6℃/min的速率升至250℃，保留5min；檢測器溫度250℃；載氣He，流速1mL/min。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量70eV，掃描范圍10～450u，離子源溫度230℃；接口溫度250℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取頭的選擇

比較固定相分別為100μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、65μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、75μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)三種萃取頭對櫻桃酒揮發(fā)性成分的萃取效果。萃取頭對香氣物質(zhì)的吸附是依據(jù)相似相溶原理，即100μm PDMS萃取頭對非極性的香氣物質(zhì)有極高的萃取能力，而65μm PDMS/DVB萃取頭主要萃取極性的揮發(fā)性成分，對胺類、醇類等的吸附和解析的效率較高[14]。

以2008年櫻桃酒為樣品，向頂空瓶中加入5mL樣品，40℃萃取30min[15]。為延長萃取頭的使用壽命，萃取過程中不對酒樣進(jìn)行磁力攪拌[16]。

根據(jù)除乙醇外的揮發(fā)性物質(zhì)的絕對峰面積總和與峰個數(shù)的多少綜合考慮來確定最佳的萃取頭材料，結(jié)果見圖1。由圖1可知，100μm PDMS、65μm PDMS/DVB、75μm CAR/PDMS 3種萃取頭萃取到的除乙醇外的揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積總和分別為573.4、1262.7和827.1；峰個數(shù)分別為43、55、38個。可見，固定相為65μm PDMS/DVB的萃取頭萃取到的芳香物質(zhì)的種類和含量最高，即萃取效果最好。

圖1 不同萃取頭對萃取效果的影響Fig.1 Effect of fiber type on volatile extraction

2.2 萃取溫度的選擇

選用65μm PDMS/DVB萃取頭，分別在20、30、40、50℃和60℃萃取30min，考察溫度對櫻桃酒香氣成分的萃取效果。結(jié)果見圖2。

圖2 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.2 Effect of temperature on volatile extraction

圖3 萃取溫度對乙醇吸附量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on ethanol adsorption

由圖3可知，5個萃取溫度萃取到的揮發(fā)性物質(zhì)的絕對峰面積總和分別為2952.5、6890.9、13844.5、23339.1、16560.8；除乙醇外的峰面積總和分別為467、620.6、1262.7、763.5和659.7；峰個數(shù)分別為29、33、55、43、61。一方面，溫度升高時較多的分析物會從基質(zhì)中逸出進(jìn)入液面上方，增加了香氣物質(zhì)的萃取效率，但超過一定溫度萃取量開始降低。其中40～50℃萃取量下降的原因可能是乙醇吸附量增大產(chǎn)生的競爭性吸附造成其他種類物質(zhì)在萃取頭上發(fā)生了解吸附，乙醇吸附量隨溫度的變化趨勢見圖3；50～60℃乙醇和其他物質(zhì)的吸附量都明顯下降，這是因為溫度升高也會降低萃取頭吸附分析組分的能力[17]。60℃物質(zhì)種類增加了很多，可能是高溫引起酒體香氣物質(zhì)發(fā)生了化學(xué)變化。故選擇40℃為最佳萃取溫度。

2.3 萃取時間的選擇

選用65μm PDMS/DVB萃取頭，溫度40℃，分別考察不同萃取時間10、20、30、40min和50min對櫻桃酒香氣成分的萃取效果。結(jié)果見圖4。

圖4 萃取時間對萃取效果的影響Fig.4 Effect of time on volatile extraction

由圖4可知，5個萃取時間萃取到的除乙醇外的揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積總和分別為689.8、618.2、1262.7、557.5和848.7，峰個數(shù)分別為36、38、55、47、53個。從圖4可看出，并不是萃取時間越長越好，從開始萃取到萃取平衡所需時間，由待測組分的分配系數(shù)、物質(zhì)的擴(kuò)散速率、樣品基質(zhì)、樣品體積、萃取頭膜厚等因素決定。一般萃取過程中均在剛開始時吸附量增加迅速，出現(xiàn)一轉(zhuǎn)折點后上升緩慢[17-18]，有的甚至出現(xiàn)下降[19]。在本實驗的實際操作中，總體香氣成分的種類和含量在萃取30min時達(dá)到最高值。所以選擇30min為最佳萃取時間，這與文獻(xiàn)[9,20]報道的結(jié)果一致。

2.4 酒精度的選擇

酒精度對峰值強(qiáng)度也有影響[21-22]。雖然酒精的影響方式還不確定，但顯然，酒精和香氣成分會在萃取頭上產(chǎn)生競爭性吸附。鑒于此，對樣品的酒精度進(jìn)行優(yōu)化。選用65μm PDMS/DVB萃取頭，溫度40℃，萃取30min，分別研究 12%(原酒)、6%(稀釋 1 倍)、3%(稀釋2倍)樣品酒精度對HS-SPME萃取效果影響的研究，結(jié)果見圖5。

圖5 酒精度對萃取效果的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on volatile extraction

3種不同酒精度的櫻桃酒中萃取到的除乙醇外的揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積總和分別為1262.7、448.2、412.9，峰個數(shù)分別為55、38個和34個。從圖5可看出，隨著稀釋倍數(shù)的增加(即樣品濃度降低)，除乙醇之外的香氣物質(zhì)種類、峰面積均隨之下降，未稀釋酒與稀釋1倍或2倍的酒其萃取的香氣物質(zhì)的量與種類均差異顯著，而稀釋1倍與稀釋2倍的酒之間差異不顯著。所以后續(xù)研究對櫻桃酒不進(jìn)行稀釋。

2.5 NaCl添加量的選擇

有研究表明，在萃取酒中的揮發(fā)性成分前進(jìn)行鹽析可增加香氣物質(zhì)在頂空的濃度[23]。硫酸鈉或氯化鈉等無機(jī)鹽在水中的溶解度較高，可增大溶液的離子強(qiáng)度，從而降低基體對揮發(fā)性物質(zhì)的束縛，提高酒中有機(jī)物質(zhì)的逸出活度，促使其從液態(tài)基質(zhì)中揮發(fā)出來，吸附到萃取頭上。但也有研究顯示，NaCl的加入會影響基質(zhì)黏度，降低分析物的擴(kuò)散速度，產(chǎn)生鹽的負(fù)效應(yīng)，即阻礙待測樣品中一些半揮發(fā)性和難揮發(fā)性組分向頂空氣體中逸散，從而降低這些物質(zhì)的提取效果[24]。所以應(yīng)該對NaCl加入量進(jìn)行優(yōu)化。

選用65μm PDMS/DVB萃取頭，溫度40℃，萃取30min，對NaCl的用量進(jìn)行優(yōu)化。研究不同電解質(zhì)NaC1質(zhì)量濃度0.00、0.05、0.10、0.20g/mL對HS-SPME萃取效果的影響。結(jié)果見圖6。

圖6 NaCl加入量對萃取效果的影響Fig.6 Effect of sodium chloride concentration on volatile extraction

圖7 不同NaCl加入量條件下的色譜圖比較Fig.7 Chromatograms of extracted volatiles using different concentrations of sodium chloride

由圖6可見，不同NaCl質(zhì)量濃度萃取到的揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積總和分別為1 3 8 44.5、3 0 2 38.8、21842.1、54365.2；除乙醇外的揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積總和分別為1262.7、854、1003.2、2357.6，峰個數(shù)分別為55、40、45、45個。鹽析可提高某幾種香氣物質(zhì)的信號強(qiáng)度，但對其他化合物的檢測靈敏性降低[16]。本實驗中加0.20g/mL氯化鈉雖然比不加鹽情況下萃取物質(zhì)總量明顯增多，但萃取物質(zhì)種類減少較多，其中不同加鹽量的色譜圖見圖7。為了能盡可能多地萃取出櫻桃酒中的不同揮發(fā)性物質(zhì)，且盡可能減少樣品的預(yù)處理步驟，因此，后續(xù)實驗對酒樣不進(jìn)行加鹽處理。

2.6 櫻桃酒中揮發(fā)性物質(zhì)的定性分析

利用HS-SPME與GC-MS聯(lián)用法在65 μ m PDMS/DVB萃取頭，萃取溫度為40℃，萃取時間為30min的條件下對櫻桃酒中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分離與鑒定。結(jié)果見圖8和表l。

圖8 中櫻狄墨爾櫻桃酒揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.8 GC-MS total ion chromatogram of volatiles in Zhongyingdimoer cherry wine

采用HS-SPME和GC-MS技術(shù)對櫻桃酒中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分離檢測，共確定65種揮發(fā)性成分，主要包括27種酯類、13種醇類、7種酸類、6種醛類、4種酮類。其中酯類、醇類和酸類分別占香氣種類總數(shù)的41.54%、20.00%和10.77%，其含量分別占香氣成分總量的56.74%、31.13%、2.85%。該櫻桃酒含量排在前十位的香氣成分依次是3-甲基-1-丁醇(22.46%)、辛酸乙酯(15.87%)、2-羥基丙酸乙酯(7.19%)、癸酸乙酯(6.58%)、乙酸乙酯(5.88%)、丁二酸二乙酯(4.03%)、鄰苯二甲酸二丁酯(3.64%)、乙酸(3.24%)、己酸乙酯(3.22%)、肉豆蔻酸乙酯(2.91%)，構(gòu)成了櫻桃酒的主要香氣成分。其中，3-甲基-1-丁醇也被確定是白蘭地[9]、賽來雄白葡萄酒[16]、紅葡萄酒[15]中含量最高的香氣物質(zhì)。

表1 HS-SPME-GC-MS法測定櫻桃酒中的揮發(fā)性成分Table 1 Volatiles and their relative contents in cherry wine analyzed by HS-SPME and GC-MS

續(xù)表1

3 結(jié) 論

3.1 對頂空固相微萃取提取櫻桃酒中揮發(fā)性成分的條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳萃取條件：65μ m PDMS/DVB萃取頭、萃取溫度40℃、萃取時間30min、酒精度12%，從而建立了快速、準(zhǔn)確測定櫻桃酒中揮發(fā)性成分的方法。該方法簡單、迅速，不需有機(jī)溶劑，測定結(jié)果可真實地反映櫻桃酒中揮發(fā)性物質(zhì)的組成。

3.2 在優(yōu)化好的條件下，利用HS-SPME-GC-MS方法分離鑒定櫻桃酒中的香氣成分，最終確定65種揮發(fā)性物質(zhì)。其中種類最多的是酯類、醇類和酸類。3-甲基-1-丁醇、辛酸乙酯、2-羥基丙酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、乙酸、己酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯是該櫻桃酒中主要的揮發(fā)性成分。

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Determination of Volatile Compounds in Cherry Wine Using Headspace-solid-phase Micro-extraction Coupled with GC-MS

ZHANG Ni1，XIAO Zuo-bing2,*，YU Hai-yan2，ZHU Jian-cai2，DAI Shui-ping1
(1. School of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China；
2. School of Perfume and Aroma Technology, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 200233, China)

The volatile compounds in cherry wine were determined using headspace-solid-phase micro-extraction (HS-SPME)coupled with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Extraction conditions such as fiber type, extraction temperature, time, ethanol concentration and sodium chloride added were optimized as follows: 65 μm PDMS/DVB fiber,extraction temperature of 40 ℃, extraction time of 30 min and ethanol concentration of 120 mL/L. Totally 65 compounds were identified in Zhongyingdimoer cherry wine, a Chinese domestic brand, where esters were the most diverse and abundant volatiles.

cherry wine；volatiles；headspace-solid-phase micro-extraction (HS-SPME)；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

TS262.7

A

1002-6630(2011)10-0097-06

2010-08-19

國家“973”前期基礎(chǔ)研究基金項目(2009CB226104)；國家自然科學(xué)基金面上項目(20876097)

張妮(1985—)，女，碩士研究生，主要從事食品科學(xué)與工程研究。E-mail：zhangni1985m@163.com

*通信作者：肖作兵(1965—)，男，教授，博士，主要從事香料香精、食品添加劑和生物工程研究。E-mail：xzb@sit.edu.cn