顧仁勇，朱愛華，王文熙，劉 杰，李佑稽

(吉首大學化學化工學院，湖南 吉首 416000)

超聲波預處理微波萃取葛根總黃酮的工藝優(yōu)化

顧仁勇，朱愛華，王文熙，劉 杰，李佑稽

(吉首大學化學化工學院，湖南 吉首 416000)

以湘西野葛根為原料，優(yōu)化葛根總黃酮超聲微波雙輔助萃取工藝。研究超聲提取溫度、超聲作用時間、微波功率、微波作用時間、固液比5個影響因素對葛根總黃酮提取量的影響，采用紫外分光光度計測定葛粉中總黃酮的含量，建立葛根總黃酮的最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，在以80%的乙醇為提取溶劑、微波輻射功率300W、微波輻射時間9min、固液比1:25(g/mL)、超聲提取溫度50℃、超聲提取時間30min的條件下，總黃酮的提取量可達14.685mg/g。

葛根；總黃酮；超聲波；微波

葛根(Radix Pueraria)為豆科植物野葛的干燥根，其味甘、辛、性平，是一種既有豐富營養(yǎng)又有獨特藥理作用的藥食兩用資源[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有解肌退熱、透發(fā)麻疹、生津止渴、升陽止瀉等功效。目前，隨著現(xiàn)代食品科技與現(xiàn)代醫(yī)藥的發(fā)展，深入研究葛根黃酮成為功能食品、醫(yī)藥工業(yè)領域的熱點問題[2-4]。

葛根除含有約占新鮮葛根20%～25%的高級淀粉以及豐富的人體必需氨基酸和礦物元素等營養(yǎng)成分外，還含有多種異黃酮、三萜類、芳香類及其他活性成分，具有多種藥理作用。其中，葛根中最重要的生理活性成分葛根總黃酮是一種天然的抗氧化劑，具有清除人體中過氧化氫、抗衰老和增加機體免疫力的作用[5-7]。在食品中它們應用于功能性食品添加劑，如天然甜味劑、天然抗氧化劑、天然色素等；應用于功能食品，如生物類黃酮口香糖、銀杏葉袋泡茶等防衰、抗癌、提高免疫力食品。在獸藥、農(nóng)藥等領域，現(xiàn)已開發(fā)出了一些具有特效功能的含有黃酮類化合物藥品和驅(qū)蟲、殺蟲劑等[8]。

葛根總黃酮的提取方法主要有醇回流法、浸漬法、超聲輔助萃取法、微波輔助萃取法等[9-11]。目前，工業(yè)上采用的熱浸提或乙醇加熱回流等傳統(tǒng)方法溶劑消耗量大、萃取時間長、效率比較低。近年來，超聲和微波輔助萃取技術在植物有效成分的提取方面得到了廣泛應用。與傳統(tǒng)的醇回流和浸漬提取法相比，超聲輔助萃取法溶劑用量較少，萃取時間較短，而微波具有穿透力強、選擇性高、加熱效率高等特點[12-14]。

本實驗以葛根為原料，以80%乙醇溶液為提取溶劑，采用超聲預處理微波萃取提取總黃酮，利用紫外可見光分光光度計測定葛根總黃酮含量，研究相關因素對其提取量的影響，并篩選出最佳的提取工藝及參數(shù)[15]。本實驗將超聲和微波兩種提取方法相結(jié)合，旨在為探索葛根黃酮的進一步開發(fā)，以及提高葛根資源的綜合利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

葛根塊 湘西州仙賜食品有限責任公司。蘆丁標準品 中國藥品生物制品鑒定所；95%乙醇等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

NJL07-3型實驗專用微波爐 南京杰全有限公司；DS-高速組織搗碎機 上海比朗儀器有限公司；GZX-9146MBE電熱恒溫鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司；UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；TMP-2上皿式電子天平 廈門欣銳儀器儀表有限公司；KQ-250型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮標準曲線繪制

精密稱取無水蘆丁對照品適量，加體積分數(shù)為75%乙醇溶液制成蘆丁質(zhì)量濃度0.2mg/mL的溶液。分別吸取該溶液2、4、6、8、10mL，置于5只50mL的容量瓶中，加蒸餾水至12mL，加質(zhì)量分數(shù)5% NaNO2溶液2mL，搖勻放置6min，加質(zhì)量分數(shù)10% Al(NO3)3溶液2mL，搖勻放置6min后，再加質(zhì)量分數(shù)4.3% NaOH溶液20mL，并加水稀釋至50mL，搖勻放置15min。將不同質(zhì)量濃度的蘆丁標準溶液在波長510nm處，以蒸餾水為空白參比，測定吸光度，并繪制黃酮質(zhì)量濃度與吸光度的標準曲線。

1.2.2 總黃酮提取工藝流程

葛根→洗凈切片→干燥→粉碎過60～120目篩→稱量→乙醇預浸→超聲處理→微波萃取→抽濾→葛根黃酮提取物

1.2.3 單因素對葛根總黃酮提取量的影響

將葛根用粉碎機粉碎，過60～120目篩，制成葛根粉。稱取葛根粉4g，按一定固液比加入體積分數(shù)80%乙醇溶液，提取溫度為50℃，預浸時間為10min，在不同的超聲溫度、超聲作用時間的條件下，然后在不同微波功率、微波作用時間、固液比的條件下，進行提取，將濾液減壓過濾，通過紫外分光光度計測定萃取液中葛根總黃酮的吸光度。

1.2.3.1 微波輻射時間對葛根總黃酮提取量的影響

選取4g過60～120目的葛根粉進行試驗。在固液比1:25(g/mL)，超聲作用時間20min，提取溫度45℃，微波輻射功率300W時分別萃取3、5、7、9、11min，通過紫外分光光度計測定萃取液中葛根總黃酮的吸光度。

1.2.3.2 超聲作用時間對葛根總黃酮提取量的影響

選取4g過60～120目的葛根粉進行試驗。按固液比為1:25加入80%乙醇溶液，在超聲提取溫度45℃條件下，分別超聲作用時間10、20、30、40、50min，再通過300W微波萃取7min，通過紫外分光光度計測定萃取液中葛根總黃酮的吸光度。

1.2.3.3 固液比對葛根總黃酮提取量的影響

選取4g過60～120目的葛根粉進行試驗。分別按為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30加入80%乙醇，在超聲作用20min，提取溫度45℃，微波輻射功率300W條件下萃取7min，通過紫外分光光度計測定萃取液中葛根總黃酮的吸光度。

1.2.3.4 超聲提取溫度對葛根總黃酮提取量的影響

選取4g過60～120目的葛根粉進行試驗。按固液比為1:25加入80%乙醇，分別在40、45、50、55、60℃條件下，超聲作用20min，再通過300W微波萃取7min，通過紫外分光光度計測定萃取液中葛根總黃酮的吸光度。

1.2.3.5 微波輻射功率對葛根總黃酮提取量的影響

選取4g過60～120目的葛根粉進行試驗。在固液比為1:25，超聲作用時間20min，提取溫度45℃，微波輻射功率200、300、400、500W時分別萃取7min，通過紫外分光光度計測定萃取液中葛根總黃酮的吸光度。

1.2.4 樣品處理與檢測

稱取4g葛根粉，經(jīng)超聲預處理微波萃取后，吸取4mL提取液于50mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至12mL，加質(zhì)量分數(shù)為5% NaNO2溶液2mL，搖勻放置6min，加質(zhì)量分數(shù)為10% Al(NO3)3溶液2mL，搖勻放置6min，加質(zhì)量分數(shù)為4.3% NaOH溶液20mL，再加水稀釋至50mL，搖勻放置15min后，測定吸光度，按照標準曲線換算樣液中總黃酮的質(zhì)量濃度，計算樣品中總黃酮的提取量。換算公式為：

式中：M為樣品中總黃酮的提取量/(mg/g)；C為總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為提取液體積/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮標準曲線方程

將實驗結(jié)果進行線性回歸得回歸方程和相關系數(shù)為：A=11.209C－0.0114(R2= 0.99956)。式中：A為吸光度；C為總黃酮的質(zhì)量濃度/(mg/mL)。結(jié)果表明，在蘆丁質(zhì)量濃度0.008～0.04mg/mL范圍內(nèi)，線性關系良好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 微波輻射時間對葛根總黃酮提取量的影響

由圖1可看出，在超聲時間、超聲溫度、微波輻射功率、固液比在一定時，微波時間越長，萃取物含量就越多，當達到9min是達到最大值。而常規(guī)萃取葛根素通常需要3～4h，從而可看出，超聲輔助微波提取可在很短的時間內(nèi)達到較好的萃取效果。

圖1 微波輻射時間對總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of microwave treatment time on extraction yield of total flavonoids

2.2.2 超聲作用時間對葛根總黃酮提取量的影響

圖2 超聲處理時間對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on extraction yield of total flavonoids

由圖2可看出，在其他一定條件下，超聲預處理時間對萃取有一定的影響，當超聲處理時間為40min時萃取效果最好。

2.2.3 固液比對葛根總黃酮提取量的影響

圖3 固液比對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

由圖3可看出，在一定條件下，不同的的固液比對萃取效果的影響很大，葛根粉與乙醇用量的最佳為1:25。

2.2.4 超聲提取溫度對葛根總黃酮提取量的影響

圖4 超聲提取溫度對總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of temperature during ultrasonic treatment on extraction yield of total flavonoids

由圖4可看出，超聲預處理溫度對總黃酮的萃取有很大影響，當溫度越高，其他條件一定時，葛根總黃酮的萃取物含量越高。溫度為45℃時，效果最佳。

2.2.5 微波輻射功率對葛根總黃酮提取量的影響

圖5 微波功率對總黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of microwave power on extraction yield of total flavonoids

由圖5可看出，微波輻射功率的高低對萃取效果有顯著的影響，當超聲時間、超聲溫度、微波時間和固液比一定時，輻射功率越高，萃取物含量也隨之升高，在300W處達到最大值。

2.3 正交試驗[16-17]

參考已有的資料，每個因素選用4個水平，采用L16(45)正交試驗，正交試驗水平表如表1所示。

表1 葛根總黃酮提取正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

表2 葛根總黃酮提取正交試驗設計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array matrix and experimental results

對表2數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of variances for extraction yield of total flavonoids with various extraction conditions

由表2、3得出各因素對實驗結(jié)果的影響都不顯著，但是各因素的影響程度不同，影響程度由大到小依次為：E＞D＞C＞A＞B?？傸S酮的最佳提取工藝條件為A2B3C2D3E3，即微波輻射功率300W、微波輻射時間9min、固液比1:25、超聲提取溫度50℃、超聲提取時間30min。

2.4 最佳工藝驗證實驗

根據(jù)正交試驗所得的最優(yōu)條件，在微波輻射功率300W、微波輻射時間9min、固液比1:25、超聲提取溫度50℃、超聲提取時間30min條件下做驗證實驗，得到總黃酮的提取量為14.685mg/g。

3 結(jié) 論

采用超聲預處理微波萃取葛根總黃酮是結(jié)合了微波對植物細胞的破壁作用、加熱作用和超聲波的空化效應，提高了黃酮的溶出速率。結(jié)果表明，在微波輻射功率300W、微波輻射時間9min、固液比1:25、超聲提取溫度50℃、超聲提取時間30min條件下，總黃酮提取量可達14.685mg/g。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典: 一部[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2000.

[2] 胡崇琳, 劉東莉, 王蕊霞, 等. 葛根總黃酮的提取及抗氧化性能評價[J]. 食品科學, 2009, 30(6): 162-165.

[3] 華輝, 郭勇. 黃酮類化合物藥理研究進展[J]. 廣東藥學, 1999, 9(4):9-12.

[4] 劉曉宇, 張俊杰, 王蕊霞. 葛根總黃酮的提取及抗氧化活性評價研究[J]. 食品科學, 2007, 28(10): 232-236.

[5] 唐瑜. 葛根素對腦缺血再灌注損傷保護機制的研究現(xiàn)狀[J]. 四川生理科學雜志, 2006, 28(4): 177-179.

[6] 高翔, 李濤, 高全, 等. 葛根素預處理與缺血預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J]. 貴陽醫(yī)學院學報, 2006, 31(6): 523-526.

[7] 龔志剛, 胡紅霞, 朱篤, 等. 葛根素對糖尿病大鼠血糖和抗氧化能力的影響[J]. 食品科學, 2006, 27(11): 498-501.

[8] 徐東翔. 植物資源化學[M]. 長沙: 湖南科學技術出版社, 2004: 17-21.

[9] 祝世發(fā), 陳文, 江發(fā)壽, 等. 葛根中葛根素的提取工藝研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2004, 15(3): 114-115.

[10] 王亞紅, 曲小姝, 祝波, 等. 葛根素提取及純化工藝研究現(xiàn)狀[J]. 天津化工, 2008, 22(6): 12-14.

[11] 金福, 易紅, 馮偉紅, 等. 葛根不同提取工藝的實驗研究[J]. 中國中藥雜志, 2009, 34(9): 1171-1172.

[12] 孔慶新, 祝冬青. 微波輔助萃取葛根總異黃酮的工藝研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2007, 35(33): 10835-10836; 10851.

[13] 王娟, 沈平嫌, 沈永嘉. 葛根中有效成分的微波輔助萃取研究[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2002, 33(8): 382-383.

[14] 張尊聽, 楊伯倫, 劉謙光, 等. 野葛根異黃酮成分的超聲萃取及抗氧化作用[J]. 食品科學, 2002, 23(5): 31-33.

[15] 麻明友, 肖卓炳, 吳顯明, 等. 葛根總黃酮的超聲微波雙輔助萃取研究[J]. 食品科學, 2009, 30(24): 242-245.

[16] 謝果, 張強國. 用正交實驗優(yōu)選葛根總黃酮的提取工藝研究[J]. 重慶科技學院學報: 自然科學版, 2006, 8(1): 46-48.

[17] 曾超珍, 劉志祥. 微波提取杜仲總黃酮的工藝研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2009, 20(5): 1170-1171.

Process Optimization for Extraction of Total Flavonoids from Radix Pueraria by Ultrasonic Followed by Microwave Treatment

GU Ren-yong，ZHU Ai-hua，WANG Wen-xi，LIU Jie，LI You-ji
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China)

Ultrasonic followed by microwave treatment was used to establish a novel method to extract total flavonoids from Radix Pueraria. The effects of five extractions, namely temperature during ultrasonic treatment, ultrasonic treatment time,microwave power and treatment time and solid-to-liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids from Radix Pueraria were explored. The quantification of total flavonoids was conducted using a UV spectrophotometer. The results showed that the maximum yield of total flavonoids could reach 14.685 mg/g was attained by using 80% ethanol as the extraction solvent at a solidto-liquid ratio of 1:25 under the assistance of 30 min ultrasonic at 50 ℃ followed by 9 min microwave treatment at 300 W power.

Radix Pueraria；flavonoids；ultrasonic；microwave

R284.2

A

1002-6630(2011)10-0057-04

2010-08-14

顧仁勇(1972—)，男，副教授，碩士，研究方向為食品加工及保藏。E-mail：gry8565398@163.com