陳振翠，汪君民

（無(wú)錫城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214064）

理論與方法探索

黃芪對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠腎臟血管緊張素Ⅱ、尿蛋白的影響

陳振翠，汪君民

（無(wú)錫城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214064）

研究黃芪和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠尿蛋白及血管緊張素Ⅱ的影響，為運(yùn)用中藥防治運(yùn)動(dòng)性蛋白尿提供新方法、新思路，并為其在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和競(jìng)賽中的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

黃芪；血管緊張素Ⅱ；尿蛋白

本實(shí)驗(yàn)以黃芪與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠進(jìn)行干預(yù)，綜合運(yùn)用中醫(yī)傳統(tǒng)的腎病辯證治療經(jīng)驗(yàn)，將傳統(tǒng)的中醫(yī)相關(guān)實(shí)踐與現(xiàn)代黃芪藥理研究相結(jié)合，探討黃芪對(duì)運(yùn)動(dòng)性蛋白尿的防治作用。

1 研究對(duì)象及實(shí)驗(yàn)分組

健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只，8周齡，體重180.2±15.1g。單籠飼養(yǎng)，自然光照，通風(fēng)良好，室溫18 ～ 25℃，相對(duì)濕度50% ～ 55%， 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物干燥飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。實(shí)驗(yàn)前先將大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)將其分為對(duì)照組、黃芪組、訓(xùn)練組，每組按處死狀態(tài)又分為兩個(gè)亞組，即安靜狀態(tài)、力竭運(yùn)動(dòng)后即刻組。（表1）

2 研究方法

2.1 黃芪水煎劑的濃度、藥量及其制備

黃芪煎劑的制備劑量以喬玉成[1]的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥量的確定及計(jì)算方法 ”確定“10ml/kg體重的黃芪煎劑，含生藥濃度約0.35g/ml，1次/天”為本實(shí)驗(yàn)的常規(guī)用藥量，并連續(xù)灌胃5周。

黃芪水煎劑的制備。黃芪70g，加自來(lái)水500ml浸泡30 ～ 40min，大火燒開(kāi)后微火煮沸約30min，提取濾液后將殘?jiān)铀?00ml，微火煮沸約30min，合并兩次濾液至200ml，制成0.35g/ml的水煎劑。每天熬制一次，運(yùn)動(dòng)前3小時(shí)灌胃。

2.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案

隨機(jī)分組后，T組進(jìn)行無(wú)負(fù)重的適應(yīng)性游泳，5只/桶，1次/天。3天適應(yīng)性游泳時(shí)間，第1天10min，第2天20min，第3天30min。水溫30±2℃。游泳桶為圓形無(wú)毒塑料桶高80cm、直徑65cm。

適應(yīng)性訓(xùn)練后，每天上午M組大鼠灌服黃芪10ml/kg體重；C組、T組大鼠灌胃等量生理鹽水，下午T組大鼠訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)間為五周。具體訓(xùn)練方案如表2。

經(jīng)過(guò)5周的灌服黃芪及訓(xùn)練后，C組、M組適應(yīng)性游泳3天，然后休息兩天。之后各組的力竭即刻組進(jìn)行大強(qiáng)度負(fù)重游泳，背部負(fù)重為其體重7%，直至力竭，記下力竭時(shí)間。

2.3 樣品的采集和制備

各組大鼠均在實(shí)驗(yàn)前常規(guī)禁食12小時(shí)，禁食期間自由飲水。腹腔注射20%氨基甲酸乙酯麻醉，注射量約為2ml/只。血漿的制備，眼球取血3ml，放入加有抗凝劑、血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素酶A抑制劑的預(yù)冷試管中，離心后置-20℃保存。尿的取樣，微量注射器抽取后精確定容，分別裝入兩組試管中，-20℃保存。

2.4 測(cè)試指標(biāo)

力竭時(shí)間、白蛋白（Alb）、β2微球蛋白（β2-Mg）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）。

2.5 測(cè)試方法

血管緊張素Ⅱ活性，β2-微球蛋白和尿白蛋白濃度均為放射免疫分析法測(cè)定。

2.6 主要試劑

血管緊張素Ⅱ、β2-微球蛋白、尿白蛋白試劑盒，均購(gòu)于北京北方生物技術(shù)研究所。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠分組

表2 大鼠遞增運(yùn)動(dòng)負(fù)荷訓(xùn)練方案

表3 大鼠血漿AngⅡ及 尿液Alb、β2-Mg的變化

表4 大鼠血漿AngⅡ與 尿液ALB、β2-Mg相關(guān)系數(shù)

3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ± SD）表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，以簡(jiǎn)單相關(guān)和偏相關(guān)分析AngⅡ與尿液Alb、β2-Mg之間的相關(guān)性。顯著性差異水平為P＜0.05，非常顯著性差異水平為P＜0.01。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1.1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和灌胃黃芪對(duì)大鼠血漿AngⅡ的影響各組大鼠血漿AngⅡ含量之間的對(duì)比（表3），與C1組的相比，M1組、T1組大鼠血漿AngⅡ含量有下降的趨勢(shì)，且P＜0.05；與C2組的相比，M2組大鼠血漿AngⅡ含量有下降的趨勢(shì)，且P＜0.01，T2組大鼠血漿AngⅡ含量明顯降低，且P＜0.01。

4.1.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和灌胃黃芪對(duì)大鼠尿液Alb濃度的變化與C1組的相比，M1組、T1組大鼠尿液Alb濃度有下降趨勢(shì)，但差異不顯著；與C2組的相比，M2組大鼠尿液Alb濃度有下降的趨勢(shì)，且P＜0.05，T2組大鼠尿液Alb濃度明顯降低，且P＜0.01。

4.1.3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和灌胃黃芪對(duì)大鼠尿液β2-Mg濃度的變化與C1組的相比，M1、T1組大鼠尿液β2-Mg濃度有下降的趨勢(shì)，但差異不顯著；與C2組的相比，M2組大鼠尿液β2-Mg濃度有下降的趨勢(shì)，且P＜0.05；T2組大鼠尿液β2-Mg濃度明顯降低，且P＜0.01。

4.2 大鼠在力竭即刻狀態(tài)AngⅡ與尿液ALB、β2-Mg偏相關(guān)分析

AngⅡ同血管平滑肌上的受體結(jié)合直接導(dǎo)致腎組織缺血、缺氧，進(jìn)而引發(fā)產(chǎn)生O2－的黃嘌呤氧化酶和中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)途徑；自由基會(huì)攻擊各種酶使其活性減弱或喪失，而腎素是一種酸性蛋白酶，因此自由基和AngⅡ之間的關(guān)系較密切。對(duì)這兩種因素與ALB和β2-Mg的關(guān)系做了偏相關(guān)分析，可以探查二者更深層次的內(nèi)在聯(lián)系。參照相關(guān)系數(shù)判斷方法：相關(guān)系數(shù)在0.3以下為無(wú)相關(guān)，0.3 ～ 0.5為低度相關(guān)，0.5 ～ 0.8為中度相關(guān)，0.8以上是高度相關(guān)。由表4可以看出，C2組和M2組AngⅡ與ALB達(dá)到了高度相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.8593、0.8829），且具有顯著性差異（P＜0.05）。C2組AngⅡ與β2-Mg也達(dá)到了中度相關(guān)（r=0.5173）。

4.3 大鼠力竭時(shí)間的變化

力竭時(shí)間變化情況，與C2組相比，M2組有上升趨勢(shì)，且P＜0.05；T2組明顯升高，且P＜0.01。

由于會(huì)展旅游屬于一種新生的旅游產(chǎn)品，所以相關(guān)的管理制度還不健全。這種情況下，會(huì)展旅游業(yè)的市場(chǎng)容易產(chǎn)生無(wú)序、紊亂的現(xiàn)象，影響行業(yè)的整體發(fā)展。即使成都市政府成立了專(zhuān)門(mén)的會(huì)展管理機(jī)構(gòu)，但是由于管理制度的不健全，仍然缺乏對(duì)會(huì)展旅游業(yè)從業(yè)人員和辦會(huì)單位的資質(zhì)審查，導(dǎo)致大量水平低下、浪費(fèi)資源的低水平會(huì)展重復(fù)舉辦，更有甚者，某些冒用政府名號(hào)舉辦的銷(xiāo)售劣質(zhì)產(chǎn)品的會(huì)展或者打著車(chē)展、漫畫(huà)展等的名號(hào)舉辦的有傷風(fēng)化的展會(huì)也得到審批通過(guò)，在社會(huì)上給會(huì)展旅游業(yè)造成了極大的負(fù)面影響。

5 分析討論

5.1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與黃芪對(duì)大鼠一般情況的影響

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有組別大鼠活潑好動(dòng)，皮毛光潔，眼睛有神。各組大鼠的體重和飲食量都呈良好的增長(zhǎng)趨勢(shì)，提示運(yùn)動(dòng)大鼠未出現(xiàn)過(guò)度訓(xùn)練的情況，對(duì)黃芪灌胃和訓(xùn)練無(wú)不良反應(yīng)。

5.2 運(yùn)動(dòng)、黃芪對(duì)大鼠血漿AngⅡ含量的影響

腎素是一種糖基化的單鏈蛋白酶。它能將肝臟合成并釋放的血管緊張素原水解為一個(gè)十肽的AngI，進(jìn)而被組織內(nèi)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶水解，去掉兩個(gè)氨基酸，從而生成一種八肽的AngⅡ，AngⅡ在血漿及組織內(nèi)的血管緊張素酶A的作用下，再失去一個(gè)氨基酸，變成七肽的AngIII。在這3種類(lèi)型中，AngⅡ的活性最強(qiáng)，被公認(rèn)為目前已知的縮血管最強(qiáng)的物質(zhì)之一，也可抑制腎素的表達(dá)。AngI對(duì)體內(nèi)大多數(shù)組織、細(xì)胞來(lái)說(shuō)基本上沒(méi)有活性；AngIII的縮血管效應(yīng)僅為AngⅡ的10%—20%。

研究表明，腎臟內(nèi)有其自身的腎素-血管緊張素系統(tǒng)，血管緊張素原mRNA主要表達(dá)在近曲小管細(xì)胞，腎素mRNA的表達(dá)主要出現(xiàn)在球旁細(xì)胞，這表明腎臟能同時(shí)生成腎素和血管緊張素原。腎血管內(nèi)皮細(xì)胞能生成血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，在外系膜細(xì)胞膜、球旁細(xì)胞膜、足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞膜、近曲小管刷狀緣上均有血管緊張素酶A。AngⅡ受體在腎內(nèi)分布廣泛，可以通過(guò)與出球小動(dòng)脈、入球小動(dòng)脈內(nèi)壁上受體結(jié)合而導(dǎo)致它們收縮，但是由于出球小動(dòng)脈對(duì)AngⅡ的敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)入球小動(dòng)脈，故一般情況下，AngⅡ最終效應(yīng)是通過(guò)出球小動(dòng)脈收縮而導(dǎo)致腎小球球后阻力顯著增加，使腎小球?yàn)V過(guò)分?jǐn)?shù)增加[2]。

腎血流減少時(shí)，腎素分泌就會(huì)增加；血漿中Na+濃度降低時(shí)，腎素分泌也會(huì)增加[3]。試驗(yàn)中，T1組、M1組大鼠血漿AngⅡ含量比C1組低，且P＜0.05，顯示5周的游泳訓(xùn)練或灌藥大鼠可以顯著降低大鼠安靜狀態(tài)下的血漿中AngⅡ水平。T2組大鼠血漿AngⅡ含量比C2組低，且P＜0.01，顯示5周的游泳訓(xùn)練可以顯著降低大鼠或灌藥大鼠力竭狀態(tài)下的血漿中AngⅡ水平。這可能是由于運(yùn)動(dòng)時(shí)應(yīng)激系統(tǒng)活動(dòng)加強(qiáng)，促使AngⅡ分泌增多，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的訓(xùn)練后，應(yīng)激系統(tǒng)得到適應(yīng)，故運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組AngⅡ水平低于非訓(xùn)練組。關(guān)宇光[4]研究提示，有氧運(yùn)動(dòng)可以降低大鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中血漿AngⅡ水平，60min和120 min的有氧運(yùn)動(dòng)相比無(wú)顯著差異。但60min有氧運(yùn)動(dòng)可以使心肌組織中AngⅡ水平顯著降低。

M2組大鼠血漿AngⅡ含量比C2組低，且P＜0.01，說(shuō)明5周灌胃黃芪水煎液可以顯著降低大鼠力竭狀態(tài)下的血漿中AngⅡ水平。這表明黃芪有抑制AngⅡ的釋放，降低血壓的作用。史大卓等[5]研究復(fù)方芪丹液可干預(yù)AMI大鼠VR的病理過(guò)程，抑制AngⅡ釋放，降低ET水平，改善動(dòng)物內(nèi)皮功能。孟立強(qiáng)等[6]研究發(fā)現(xiàn)黃芪當(dāng)歸合劑對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）模型大鼠腎臟血管活性物質(zhì)變化的影響主要表現(xiàn)為早期降低腎內(nèi)縮血管物質(zhì)AngⅡ水平、持續(xù)增強(qiáng)eNOS活性使舒血管物質(zhì)內(nèi)皮源性NO產(chǎn)生增加，從而可能降低血管張力、改善腎臟的缺血/缺氧狀態(tài)，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。

5.3 運(yùn)動(dòng)、黃芪對(duì)大鼠尿液Alb及β2-Mg濃度的影響

5.3.1 運(yùn)動(dòng)、黃芪對(duì)大鼠尿液Alb濃度的影響臨床上，若出現(xiàn)入球毛細(xì)血管壓升高、腎小球基底膜濾過(guò)孔徑增大、腎小管重吸收能力下降及血漿中、小分子量蛋白質(zhì)增多等時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)微量或臨床白蛋白尿。

本研究中，M1組、T1組與C1組大鼠尿液白蛋白含量差異不顯著，說(shuō)明大鼠在灌胃黃芪或訓(xùn)練期間沒(méi)有對(duì)腎臟結(jié)構(gòu)及功能有不良的影響。T2組大鼠尿液Alb濃度低于C2組，且P＜0.01，說(shuō)明訓(xùn)練顯著降低大鼠力竭即刻尿液中的白蛋白濃度，其機(jī)理有可能是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，引起腎臟損傷的“閾值”調(diào)高，力竭時(shí)腎小球和腎小管損傷減輕，白蛋白濾出量減少。同樣，M2組大鼠尿液Alb濃度比C2組低，且P＜0.05，說(shuō)明灌胃黃芪可顯著降低運(yùn)動(dòng)大鼠或大鼠力竭即刻尿液中白蛋白的濃度，可能由于黃芪煎劑使大鼠在力竭時(shí)，腎小球?yàn)V過(guò)膜和/或腎小管得到一定程度的保護(hù)，白蛋白濾出量隨著減少。孫健等[7]研究發(fā)現(xiàn)EGb能清除體內(nèi)過(guò)多氧自由基，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，改善腎小球基底膜通透性，減輕腎小球系膜基質(zhì)積累，防止腎小球硬化而減少尿蛋白丟失。

5.3.2 運(yùn)動(dòng)、黃芪對(duì)大鼠尿液β2-Mg濃度的影響β2-Mg以游離形式存在于血、尿、腦脊液等體液中。T1組、M1組與C1組大鼠尿液β2-微球蛋白含量差異不顯著，說(shuō)明大鼠或運(yùn)動(dòng)大鼠在灌胃黃芪或訓(xùn)練期間沒(méi)有出現(xiàn)對(duì)腎臟結(jié)構(gòu)及腎功能有不良的影響。

T2組大鼠尿液β2-Mg濃度比C2組低，且P＜0.01，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以顯著降低大鼠力竭即刻尿液中的β2-Mg濃度，其機(jī)理是由于經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，引起腎臟損傷的“閾值”上調(diào)，大鼠在力竭時(shí)腎小球損傷減輕，白蛋白濾出量減少的同時(shí)，減輕了腎小管的負(fù)擔(dān)，加大了β2-Mg的吸收，所以β2-Mg濾出量減少。

M2組大鼠尿液β2-Mg濃度比C2組低，且P＜0.05，說(shuō)明灌胃黃芪水煎液可以顯著降低大鼠力竭即刻尿液中β2-Mg的濃度，可能是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的灌服黃芪使大鼠在力竭時(shí)，腎小球?yàn)V過(guò)膜和/或腎小管由于黃芪作用得到一定程度的保護(hù)，損傷程度減輕，所以β2-Mg濾出量隨著減少。

5.4 大鼠血漿AngⅡ與尿液Alb、β2-Mg的相關(guān)分析

在本實(shí)驗(yàn)中，大鼠力竭后，C2、M2組的偏相關(guān)表明，Alb與AngⅡ呈現(xiàn)高度正相關(guān)（r分別為0.8593和0.8829）。而C2組的β2-Mg濃度有所增加，與AngⅡ的相關(guān)系數(shù)達(dá)到了中度相關(guān)（r=0.5173）。表明AngⅡ促進(jìn)了蛋白尿中白蛋白（Alb）的產(chǎn)生，也是蛋白尿中小分子（β2-Mg）產(chǎn)生的機(jī)制之一。

馬依彤[8]認(rèn)為，AngⅡ能改變腎小球?yàn)V過(guò)膜孔徑屏障，增加大孔物質(zhì)通透性。依照這種觀點(diǎn)，AngⅡ通過(guò)增加濾過(guò)分?jǐn)?shù)而使腎小球毛細(xì)血管中血漿大分子物質(zhì)的濃度增加，從而造成大分子物質(zhì)從腎小球中濾出增加并最終形成大分子蛋白尿。從以上分析看出大量白蛋白以及更大分子量的蛋白質(zhì)的出現(xiàn)與AngⅡ的活性有很大關(guān)系。陳偉、湯長(zhǎng)發(fā)[9]發(fā)現(xiàn)力竭游泳后Alb排泄率與AngⅡ濃度正相關(guān)，認(rèn)為AngⅡ的作用位點(diǎn)是腎小球而非腎小管，但AngⅡ作用于腎小球而引起的血流動(dòng)力學(xué)改變可能間接影響腎小管的重吸收功能，從而使β2-Mg的排泄率大大增加，與本研究結(jié)果相近。

據(jù)此，筆者認(rèn)為產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性蛋白尿中大分子生成機(jī)制與腎素血管緊張素系統(tǒng)密切相關(guān)，而蛋白尿中小分子生成的機(jī)制與腎素血管緊張素相關(guān)性呈中度，但尚需要更多的實(shí)驗(yàn)證明。

5.5 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與黃芪對(duì)大鼠力竭時(shí)間的影響

力竭時(shí)間是機(jī)體的抗應(yīng)激能力、抗疲勞能力等多種作用的綜合體現(xiàn)，是衡量機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力的重要直接指標(biāo)。許多研究表明，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和黃芪制劑可以延遲疲勞產(chǎn)生，提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力，延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間。

與C2組相比，M2組大鼠的力竭時(shí)間明顯延長(zhǎng)，且P＜0.05。張全江等[10]研究表明，耐力運(yùn)動(dòng)能顯著提高機(jī)體的抗疲勞能力，延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間。與C2組相比，T2組上升，且P＜0.01。表明黃芪能提高大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，可能與此黃芪含有抗疲勞的成分有關(guān)。周志宏等人實(shí)驗(yàn)提出，服用補(bǔ)腎益元方小鼠游泳至力竭時(shí)間運(yùn)動(dòng)較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)（P＜0.05）[11]。

綜上所述，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和黃芪可能通過(guò)抗氧化或通過(guò)降低血漿AngⅡ的水平，降低了蛋白尿中絕大多數(shù)大分子蛋白質(zhì)和少部分小分子蛋白質(zhì)的排出，使機(jī)體處于較好的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，進(jìn)而提高運(yùn)動(dòng)能力。

6 結(jié) 論

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和灌胃黃芪都能提高大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，但單一灌胃黃芪運(yùn)動(dòng)能力提高不明顯。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和灌胃黃芪都能較好地降低大鼠在安靜狀態(tài)、力竭即刻狀態(tài)血漿AngⅡ含量，降低運(yùn)動(dòng)力竭即刻大鼠尿液Alb及β2-Mg濃度；黃芪可能參與了AngⅡ生成的調(diào)節(jié)，而AngⅡ機(jī)制參與了大分子（Alb）蛋白尿的形成，也可能參與了小分子（β2-Mg）蛋白尿的生成，但后者需要更多的實(shí)驗(yàn)證明。

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10.3969/j.issn.1674-151x.2011.10.022

投稿日期：2011-05-12

陳振翠（1974 ～），講師。研究方向：體育教育。