張志瑞，陳莉婭，任衛(wèi)萍，楊 芒

（1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院口腔科，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院口腔科，甘肅 蘭州 730000）

甘肅省漢族、回族人非綜合征唇腭裂與轉(zhuǎn)化生長因子-α的基因多態(tài)性相關(guān)性研究

張志瑞1，陳莉婭1，任衛(wèi)萍2，楊 芒1

（1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院口腔科，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院口腔科，甘肅 蘭州 730000）

目的研究甘肅省漢族和回族人非綜合征唇腭裂與轉(zhuǎn)化生長因子-α（Transforming Growth Fator-α，TGF-α）基因多態(tài)性的相關(guān)性。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)——限制性酶切片段長度多態(tài)（PCR-RFLP）的方法對50例漢族非綜合征唇腭裂患者與25例正常漢族人，50例回族非綜合征唇腭裂患者與18例正?；刈迦诉M行TGF-α基因檢測分析。結(jié)果甘肅省漢族、回族非綜合征唇腭裂（NSCL/P）患者的C2等位基因頻率較正常人明顯增高，2組比較有顯著性差異（P<0.05），漢族和回族人NSCL/P患者等位基因頻率、基因型均無顯著性差異。結(jié)論TGF-α基因多態(tài)性與甘肅省漢族、回族人群非綜合征唇腭裂的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。

甘肅省漢族、回族人；非綜合征唇腭裂；轉(zhuǎn)化生長因子-α；基因多態(tài)性

唇腭裂是口腔顏面部最常見的發(fā)育畸形，常伴發(fā)牙頜系統(tǒng)畸形，是一種復(fù)雜的、由遺傳和環(huán)境因素相互作用所致的多基因、多因素遺傳病。而非綜合征唇腭裂（NSCL/P）是指不伴有全身其他疾病的單純的唇裂或腭裂與唇裂伴腭裂。國內(nèi)外研究證明，遺傳因素在非綜合征唇腭裂的發(fā)病因素中占有舉足輕重的地位。由于唇腭裂病因的復(fù)雜性、遺傳模式的不確定性、不同地區(qū)甚至不同表型NSCL/P的候選基因存在差異，有大量的研究數(shù)據(jù)表明，唇腭裂的發(fā)生存在人種、地域的差異。

本研究通過采用聚合酶鏈反應(yīng)——限制性酶切片段長度多態(tài)（PCR-RFLP）的方法，對甘肅省50例漢族非綜合征唇腭裂患者與25例漢族正常人，50例回族非綜合征唇腭裂患者與18例回族正常人進行TGF-α的研究，進一步探究TGF-α基因與甘肅省漢族、回族人群非綜合征唇腭裂發(fā)生的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1主要試劑和儀器

PCR擴增試劑盒（天根生物公司生產(chǎn)），限制性內(nèi)切酶、耐熱DNA多聚酶、DNA Marer、瓊脂糖為Promega公司產(chǎn)品，血液DNA提取試劑盒及淋巴細胞分離液（均購自上海生工生物公司），TGF-α基因TaqI限制性片段多態(tài)性特異性PCR擴增引物[1]，上游引物為：5’-TCA CTTCCC CTT TTTCATCTG-T-3’，下游引物為：CGA GGA GGC TCTGAG GTG-3’。Gerpro凝膠自動分析和成像系統(tǒng)、ABI9700PCR擴增儀（美國制造），水平離心機（北京醫(yī)學(xué)離心機廠制造），Heraeus低溫高溫離心機（德國制造）。

1.2 病例選擇

非綜合征唇腭裂患者均為在甘肅省內(nèi)長期居住并參加了蘭州大學(xué)第一醫(yī)院口腔頜面外科“微笑行動”與“微笑列車”活動的患者。選取漢族、回族單純唇裂或單純腭裂或唇裂合并腭裂的非綜合征患者為實驗組，年齡3個月～18歲。對照組均為相應(yīng)民族正常人志愿者，參試者均在知情同意下進行，且無系統(tǒng)性疾病，近期未服用藥物。

1.3 方法

所有參試者抽取外周血3m l加EDTA抗凝后，嚴(yán)格按照純化試劑盒的操作說明提取DNA，用核酸分析儀進行DNA的定量，稀釋后備用。反應(yīng)體系：PCR總反應(yīng)體系25μl，其中含待測模板1μl，dNTP 2.5μl，TaqDNA聚合酶1μl及其相應(yīng)的10xbuffer2.5μl，上、下游引物各1μl，用去離子水補足14μl，2xTapPCR Mastermix（Mgcl2，dNTP，Taq 酶，緩沖液 ）放入 PCR擴增儀內(nèi)，93℃預(yù)變性 3min，93℃變性 30 s，54.5℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，10 個循環(huán)，然后 93℃變性 30 s，54.5℃退火 30 s，72℃延伸30 s，22個循環(huán)，最后72℃延伸 10min。取PCR產(chǎn)物10μl，加TaqI限制性內(nèi)切酶8 U及相應(yīng)的10xbuffer 2μl，0.1%BSA 2μl，65℃水浴酶切6 h以上。電泳分析酶切產(chǎn)物，取15μl酶切產(chǎn)物上樣，在4%瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，確定個體的基因型。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 TGF-α基因型分析

PCR擴增產(chǎn)物為一條178 bp（174 bp）片段，經(jīng)過TaqI酶切后可產(chǎn)生 2條片段（122 bp和 52 bp），3種基因型：（1）C1C1型（正常純合子），僅有178 bp一條片段且不能被酶切；（2）C1C2型（雜合子），酶切后產(chǎn)178 bp、122 bp和52 bp 3條片段；（3）C2C2型（突變純合子），產(chǎn)生122 bp及52 bp 2條片段。

2.2 TGF-α/Taq I基因多態(tài)性（見表1）

表1 實驗組與對照組TGF-α的等位基因與基因型的分布頻率

根據(jù)電泳結(jié)果確定被檢測人員的基因型及基因頻率，如表1所示，漢、回族實驗組與對照組的TGF-α等位基因C2頻率比較有顯著性差異（P＜0.05），而漢、回族人群非綜合征唇腭裂組等位基因頻率無顯著性差異（P＞0.05），C1C1、C1C2、C2C2 基因型頻率無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

近年來研究表明，新生兒畸形率呈上升趨勢，而唇腭裂畸形發(fā)生率上升較為迅速，我國的發(fā)病率為0.182%[1]。盡管其發(fā)病因素不明確，但遺傳和孕期環(huán)境因素是目前公認(rèn)的發(fā)病原因，其中基因的多態(tài)性變異成為主要的致病因素。TGF-α是一種生長因子，屬于表皮生長因子家族，能刺激上皮細胞的增生并誘導(dǎo)其分化，對許多細胞的生長具有調(diào)節(jié)作用。在小鼠發(fā)育的腭突中，TGF-α得以廣泛表達，該基因可刺激腭突細胞合成細胞外基質(zhì)，對腭突的生長、上抬和融合都有重要的作用[2]。1989年，Ardinger等[3]首次以高加索人群為研究對象，發(fā)現(xiàn)TGF-α基因多態(tài)性與非綜合征唇腭裂有顯著的關(guān)聯(lián)，而Yasushi等[4]的研究也發(fā)現(xiàn)，該基因的多態(tài)性與NSCL/P的發(fā)生存在相關(guān)性；Lidra等[5]對菲律賓人群的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-α與NSCL/P的發(fā)生無關(guān)聯(lián)，國內(nèi)學(xué)者袁奎封[6]的研究表明，TGF-α可能與山東漢族人非綜合征唇腭裂的發(fā)生有關(guān)，由此可見，TGF-α基因在非綜合征唇腭裂發(fā)生中的作用存在人群特異性。本研究采集漢族、回族非綜合征唇腭裂患者及相應(yīng)民族的健康人對照，分別抽取其外周血，通過分子生物學(xué)PCR的方法，分析位于2號染色體上的基因位點[7]——TGF-α與甘肅省漢族、回族人群非綜合征唇腭裂有顯著關(guān)聯(lián)，而在甘肅省漢族、回族人群非綜合征唇腭裂患者之間無顯著性差異，這說明TGF-α可能是甘肅省漢族、回族人群非綜合征唇腭裂患者的候選基因，但在漢、回族之間并無特異性的選擇，這將為我們今后對唇腭裂發(fā)生的候選基因的探究提供參考依據(jù)。

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[5]Lidral AC，Murray JC，Buetow KH，et al.Studies of the candidate genes TGFB2，MSX1，TGA，andTGFB3 in the etiology of cleft lip and palate in the philippines[J].Cleft Palate Craniofac J，1997（34）：1～6.

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1671-1246（2011）16-0104-02

Vol.29 2011 No.16

蘭州大學(xué)青年基金資助項目（2010-1-12）