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        木瓜蛋白酶的活力檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)研究

        2011-10-25 00:17:42張興燦陳朝銀李汝榮
        食品工業(yè)科技 2011年10期
        關(guān)鍵詞:氯乙酸酪蛋白酪氨酸

        張興燦,陳朝銀,李汝榮

        (昆明理工大學(xué)-清華大學(xué)生物資源開發(fā)研究所,云南昆明650224)

        木瓜蛋白酶的活力檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)研究

        張興燦,陳朝銀*,李汝榮

        (昆明理工大學(xué)-清華大學(xué)生物資源開發(fā)研究所,云南昆明650224)

        分別按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中紫外分光光度法測(cè)定了兩個(gè)酶制劑企業(yè)生產(chǎn)的木瓜蛋白酶酶活力,結(jié)果表明,企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的酶活力兩種方法測(cè)定的結(jié)果差別高達(dá)幾十倍,原因可能與底物溶液的pH、反應(yīng)條件和巰基還原劑半胱氨酸鹽酸鹽有關(guān)。

        木瓜蛋白酶,酶活測(cè)定,標(biāo)準(zhǔn)*

        木瓜蛋白酶(Papain,EC 31412212)是一種具有廣泛底物專一性的含巰基蛋白酶,有很強(qiáng)的分解蛋白質(zhì)的能力,此外也具有水解酰胺鍵和酯鍵的特性[1]。由于它具有適用pH范圍廣、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、紡織、制革、飼料、染料等工業(yè)生產(chǎn)中?;盍κ堑鞍酌缸钪匾馁|(zhì)量指標(biāo),目前國(guó)家僅有蛋白酶制劑的通用標(biāo)準(zhǔn)[2],由于對(duì)各類蛋白酶制劑尚無標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,企業(yè)、生產(chǎn)廠商通常根據(jù)國(guó)家蛋白酶制劑通用標(biāo)準(zhǔn)制定自己公司特定蛋白酶的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。例如,目前我國(guó)的一些植物蛋白酶制劑工廠已在生產(chǎn)木瓜蛋白酶,但對(duì)于木瓜蛋白酶的質(zhì)量檢測(cè),特別是酶活性檢測(cè)的方法、條件和標(biāo)準(zhǔn)比較混亂,使產(chǎn)品保存和銷售受到嚴(yán)重影響[3]。為了提高產(chǎn)品質(zhì)量,增強(qiáng)國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)能力,亟待加強(qiáng)管理和統(tǒng)一檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)我們研究發(fā)現(xiàn),企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的酶活力的差值竟然高達(dá)幾十倍,這說明我國(guó)的酶制劑市場(chǎng)存在著較大的漏洞。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        樣品 選用兩個(gè)酶制劑公司生產(chǎn)的木瓜蛋白酶產(chǎn)品,以酪蛋白為底物,測(cè)定木瓜蛋白酶的酶活性;酶活力單位定義 在測(cè)定條件下每分鐘水解酪蛋白釋放出的三氯乙酸可溶物在280nm處的消光值相當(dāng)于濃度為1μg/mL酪氨酸消光時(shí)所需的酶量,為一個(gè)酶活力單位(U)。

        Ultrospec2100型紫外分光光度計(jì) Amersham Pharmacia公司;HH-S型恒溫水浴鍋 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;實(shí)驗(yàn)所用試劑 均為分析純。

        1.2 國(guó)標(biāo)GB/T 23527-2009規(guī)定的方法[4]

        1.2.1 試劑與溶液

        1.2.1.1 三氯乙酸 稱取三氯乙酸65.4g/L,用水溶解并定容至1000mL。

        1.2.1.2 緩沖溶液 因?yàn)槟竟系鞍酌甘侵行缘鞍酌?,采用磷酸緩沖液(pH=7.5),分別稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)0.5g,加水溶解并定容至1000mL。

        1.2.1.3 L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100μg/mL) 精確稱取預(yù)先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸(0.1000±0.0002)g,用1mol/L鹽酸溶液60mL溶解后定容至100mL,即為1mg/mL酪氨酸溶液。

        吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL,用0.1mol/L鹽酸溶液定容至100mL,即得到100μg/mL的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

        1.2.1.4 氫氧化鈉溶液(20g/L) 稱取氫氧化鈉片劑20.0g,加水900mL并攪拌溶解。待溶液到室溫后,以水定容至1000mL,攪拌均勻。

        1.2.1.5 鹽酸溶液 濃度為1mol/L及0.1mol/L,按GB/T 601配制。

        1.2.1.6 酪蛋白溶液(10.0g/L) 稱取標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白(NICPBP國(guó)家藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))1.000g,精確至0.001g,用少量氫氧化鈉溶液潤(rùn)濕,加入相應(yīng)的緩沖溶液約80mL,在沸水浴中加熱煮沸30min,并不時(shí)攪拌至酪蛋白全部溶解。冷卻到室溫后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中,用適宜的pH緩沖溶液稀釋至刻度。定容前檢查并調(diào)整pH至相應(yīng)緩沖液的規(guī)定值。此溶液在冰箱內(nèi)貯存,有效期為3d。使用前重新確認(rèn)并調(diào)整pH至規(guī)定值。

        1.2.2 分析步驟

        1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:按表1配制。L-酪氨酸稀釋液應(yīng)在稀釋后立即進(jìn)行測(cè)定。

        表1 L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液

        分別取上述所配的溶液,以0管為空白,利用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)275nm下測(cè)定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo),酪氨酸的濃度c為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用回歸方程,計(jì)算出吸光度為1時(shí)的酪氨酸的量(μg),即為吸光常數(shù)K值。其K值應(yīng)在130~135范圍內(nèi),如不符合,需重新配制試劑,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        1.2.2.2 樣品的測(cè)定 待測(cè)酶液的制備:稱取酶樣品1~2g,精確至0.0002g。然后用相應(yīng)的緩沖溶液充分溶解,然后取濾液(慢性定性濾紙)稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?。測(cè)定:先將酪蛋白溶液置于(40±0.2)℃恒溫水浴中,預(yù)熱5min,然后按以下流程操作:

        式(1)中:X1—由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的樣品最終稀釋液的酶活力,u/mL;X2—樣品的酶活力,u/g;V—溶解樣品所使用容量瓶的體積,mL;n—稀釋倍數(shù);8—反應(yīng)試劑的總體積,mL;2—吸取酶液的體積,mL;m—樣品的質(zhì)量,g;1/10—反應(yīng)時(shí)間10min,以1min計(jì)。

        1.3 按兩個(gè)公司各自的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定[5-6]

        其中一個(gè)公司的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為Q/JWLSW 01-2007(木瓜蛋白酶),另一個(gè)公司的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為Q/NPB 01-2009(木瓜蛋白酶),兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容基本一致。

        1.2.3 結(jié)果計(jì)算 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品最終稀釋液的酶活力,單位為u/mL。樣品的酶活力按下式計(jì)算:

        1.3.1 溶劑

        1.3.1.1 0.05mol/L磷酸氫二鈉溶液 稱取8.955g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)到500mL容量瓶,用純水溶解并稀釋至刻度,搖勻備用(加一滴甲苯防腐)。

        1.3.1.2 酶緩沖液(現(xiàn)配現(xiàn)用) 稱取0.528g L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.2236g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA),用0.05mol/L磷酸氫二鈉溶液分別溶解(共加入約90mL),合并混勻,用0.1mol/L氫氧化鈉溶液或0.1mol/L鹽酸調(diào)pH=6.0,定容到100mL。

        1.3.1.3 酪蛋白溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用) 稱取0.600g酪蛋白(標(biāo)準(zhǔn)至0.001g),加入0.05mol/L磷酸氫二鈉溶液80mL,60℃水?dāng)嚢枞芙?,?.1mol/L鹽酸調(diào)pH=6.0,用純水定容到100mL,(40±0.2)℃保溫備用。

        1.3.1.4 三氯乙酸溶液 稱取2.994g乙酸鈉,1.982g乙酸,1.798g三氯乙酸,用純水分別溶解后混合,定容到100mL容量瓶中,搖勻備用。

        1.3.1.5 待測(cè)酶溶液 稱取待測(cè)木瓜蛋白酶適量(精確到0.001g),置100mL容量瓶中,加5mL酶緩沖液浸泡20min,加水至刻度,搖勻后,吸取1.0mL到25mL容量瓶中,加酶緩沖液至刻度,搖勻。

        1.3.2 測(cè)試步驟

        1.3.2.1 待測(cè)酶溶液的測(cè)試 量取1.0mL待測(cè)酶溶液置于具塞試管中,在(40±0.2)℃水浴鍋中水浴10min,迅速加入酪蛋白溶液5.0mL,振蕩使之充分混合后封口放回水浴,精確計(jì)時(shí)10min,加入三氯乙酸溶液5.0mL,立即搖勻,過濾。用純水作為空白,在275nm下測(cè)定濾液的吸光度A1。

        1.3.2.2 待測(cè)酶的空白測(cè)試 量取1.0mL待測(cè)酶溶液置于具塞試管中,在(40±0.2)℃水浴鍋中水浴10min,迅速加入三氯乙酸溶液5.0mL,振蕩使之充分混合后封口放回水浴,計(jì)時(shí)10min,加入酪蛋白溶液5.0mL,立即搖勻,過濾。用純水作為空白,在280nm下測(cè)定溶液的吸光度A2。

        1.3.2.3 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液配制和測(cè)試 稱取0.050g L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.001g)至1000mL容量瓶中,用0.1mol/L鹽酸溶解并稀釋到刻度(此為50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液)。以純水作空白,在280nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A3。

        1.3.3 結(jié)果計(jì)算 試樣中酶活力X1(u/g)按下式計(jì)算:

        式(2)中:A1—待測(cè)酶溶液測(cè)試濾液的吸光度;A2—待測(cè)酶空白測(cè)試濾液的吸光度;A3—酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度;n—待測(cè)酶樣品的稀釋倍數(shù);m—待測(cè)酶樣品的質(zhì)量,g。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 由所配制的酪氨酸稀釋液測(cè)定的吸光度數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

        由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的回歸方程為:Y=0.0077X,相關(guān)系數(shù)R=0.9979,經(jīng)計(jì)算吸光常數(shù)k=130,符合實(shí)驗(yàn)要求。

        2.2 兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)得的酶活力結(jié)果

        對(duì)比表2和表3可以看出,在兩個(gè)不同的標(biāo)準(zhǔn)下測(cè)定的酶活力值有著高達(dá)幾十倍的差值。

        表4 企業(yè)二的木瓜蛋白酶的酶活力結(jié)果

        圖1 酪氨酸溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

        表2 企業(yè)一提供的三種木瓜蛋白酶樣品按國(guó)標(biāo)測(cè)定的酶活力結(jié)果

        表3 企業(yè)一提供的三種樣品按其企標(biāo)測(cè)定的酶活力結(jié)果

        3 討論

        3.1 酪蛋白溶液配制方法的影響

        國(guó)標(biāo)中酪蛋白溶液配制完后其pH調(diào)節(jié)至7.5,而企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的酪蛋白溶液是調(diào)節(jié)pH至6.0。可能是在pH為6.0條件下,酶活力較高。

        3.2 反應(yīng)條件的影響

        國(guó)標(biāo)中是在加入三氯乙酸后靜置10min再進(jìn)行過濾,這樣蛋白質(zhì)就基本完全除掉了,而企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中是加入三氯乙酸混勻后直接進(jìn)行過濾,可能的結(jié)果就是蛋白質(zhì)沒有完全沉淀下來,這可能會(huì)導(dǎo)致測(cè)出酶活力值較大。

        3.3 半胱氨酸鹽酸鹽的作用

        企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中配制的酶緩沖液中含有半胱氨酸鹽酸鹽,這也是影響最后結(jié)果的一個(gè)重要原因。半胱氨酸是一種還原劑,它通過改變蛋白質(zhì)分子之間和蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的二硫鍵,減弱了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),這樣蛋白質(zhì)就伸展開來,從而使酶分子更易作用于折疊的蛋白質(zhì)肽鍵,使肽鏈更易被水解。

        4 結(jié)論

        目前對(duì)于動(dòng)植物組織提取的蛋白酶制劑,國(guó)家還沒有制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn),像蛋白酶制劑國(guó)標(biāo)GB/T 23527-2009中明確規(guī)定該標(biāo)準(zhǔn)不適用于動(dòng)植物組織提取的蛋白酶制劑。由于國(guó)家還沒有制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn),就使動(dòng)植物組織提取的蛋白酶制劑的酶活力測(cè)定沒有依據(jù)可循,造成其市場(chǎng)比較混亂。

        關(guān)于木瓜蛋白酶活力測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn),方煥[3]等人早就已經(jīng)討論過,他們比較討論了木瓜蛋白酶的三種活性檢測(cè)方法,結(jié)果表明,以酪蛋白為底物的紫外分光光度法操作簡(jiǎn)便、成本低廉,適于酶純化過程中的活性比較和木瓜蛋白酶系列產(chǎn)品及國(guó)內(nèi)商品酶的活性測(cè)定;以BAEE為底物的光學(xué)法反應(yīng)穩(wěn)定、重復(fù)性好,適于酶學(xué)性質(zhì)的理論研究和出口商品酶的活性測(cè)定;以酪蛋白為底物的茚三酮顯色法,雖然操作煩瑣,但所需儀器簡(jiǎn)單,測(cè)定結(jié)果誤差較小,非常適用于條件簡(jiǎn)陋的地區(qū)。本文中測(cè)定木瓜蛋白酶的活力均是采用上面的第一種方法,即以酪蛋白為底物的紫外分光光度法,正是由于這種方法操作簡(jiǎn)便、成本低廉,當(dāng)前我國(guó)許多關(guān)于酶制劑的標(biāo)準(zhǔn)幾乎都采用的是這種方法。

        由于動(dòng)植物資源有限,工業(yè)上生產(chǎn)蛋白酶制劑主要利用枯草桿菌、棲土曲霉等微生物發(fā)酵制備,但是像木瓜蛋白酶這樣的動(dòng)植物組織提取的酶制劑也占據(jù)巨大的市場(chǎng)份額,因此國(guó)家有必要制定關(guān)于動(dòng)植物組織提取的蛋白酶制劑的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),以便人們能夠在市場(chǎng)更加方便的進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

        [1]路英華.蛋白酶的研究進(jìn)展[J].生物科學(xué)信息,1991,3(2):8-10.

        [2]凌奧漢,吳顯榮.木瓜蛋白酶與番木瓜栽培[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1998:107.

        [3]方煥,生吉萍,吳顯榮.工業(yè)生產(chǎn)中木瓜蛋白酶的活性檢測(cè)方法比較[J].食品與機(jī)械,2000(6):27-29.

        [4]GB/T 23527-2009中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 蛋白酶制劑[S].

        [5]Q/JWLSW 01-2007廣西南寧杰沃利生物制品有限公司企業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 木瓜蛋白酶[S].

        [6]Q/NPB 01-2009廣西南寧龐博生物工程有限公司企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)木瓜蛋白酶[S].

        Study on determination standards of papain activity

        ZHANG Xing-can,CHEN Chao-yin,LI Ru-rong

        (InstituteofBioresourceR&DofKunmingUniversityofScienceandTechnology-TsinghuaUniversity,Kunming650224,China)

        The determination standards of enzyme activity of papain got from two companies depended on National standards and Enterprise standards was studied respectively,found that the results had great differences.Then possible reasons were analyzed,the main influential factors may be pH of substrate,reaction conditions and cysteine hydrochloride.

        papain;determination of enzyme activity;standard

        TS207.2

        A

        1002-0306(2011)10-0435-03

        2010-10-08 * 通訊聯(lián)系人

        張興燦(1987-),男,在讀碩士,研究方向:生物技術(shù)制藥。

        云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009EB081)。

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