王 燕，趙力超，陳潔蘭，劉曉娟，劉 欣

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

菠蘿蛋白酶工業(yè)化提取工藝的改良及酶學(xué)性質(zhì)研究

王 燕，趙力超，陳潔蘭，劉曉娟，劉 欣*

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

以菠蘿莖為原料，利用微濾除雜、超濾濃縮分離得菠蘿蛋白酶濃縮液，再通過硫酸銨法進行沉淀，最后進行真空冷凍干燥制取菠蘿蛋白粗酶；而為了驗證其酶學(xué)性質(zhì)，采用Sephadex G-100柱層析和DEAE-52離子交換層析制得純度較高的菠蘿蛋白酶。結(jié)果表明：菠蘿莖打漿后原液通過微濾除雜、超濾濃縮，再采用90%硫酸銨沉淀等工序后，純化倍數(shù)達1.44，是目前工廠制酶的1.19倍，酶活收率與原液相比只降低9%，具有工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)越性；經(jīng)Sephadex G-100柱層析和DEAE-52柱層析后，達到電泳純，可滿足醫(yī)藥用酶所需，存在很好的市場應(yīng)用價值；且該菠蘿蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)與有關(guān)報道基本一致，最適反應(yīng)pH在5～6之間，最適溫度60℃，重金屬離子如Cu2+、Fe2+、Pb2+等對菠蘿莖蛋白酶活抑制較大，而Na+、K+、Ca2+則表現(xiàn)出不同程度的激活作用。

菠蘿莖蛋白酶，提取，純化，酶學(xué)性質(zhì)

我國菠蘿資源豐富，菠蘿莖是菠蘿采收后留下的副產(chǎn)物，每公頃產(chǎn)量達37.5～45t[1]，除少量用于提取菠蘿蛋白酶外，大部分未得到利用。目前用于工業(yè)化生產(chǎn)菠蘿蛋白酶的主要方法為傳統(tǒng)工藝的高嶺土吸附法和單寧沉淀法，以及新工藝的超濾濃縮法。其中高嶺土吸附法工藝操作步驟繁瑣，消耗原材料較多，設(shè)備要求較高，且酶活總回收率低[2-3]；單寧沉淀法工藝操作相對高嶺土吸附法簡單，原材料消耗少，所需設(shè)備少，但酶活回收率較低[2-3]；超濾法操作步驟少，條件溫和，降低了酶活損失，但所得酶制品中含有雜蛋白較多[2-4]，所得酶活性不足以滿足醫(yī)藥級別及食品中對酶活要求較高的應(yīng)用。而常規(guī)蛋白分子的分離提取常用硫酸銨沉淀法[5]，其對于蛋白（酶）具有顯著的鹽析作用，可以通過控制硫酸銨加入量，以分級鹽析的方式對粗提液中的酶進行預(yù)提純。目前，硫酸銨沉淀法已普遍用于多種酶的工業(yè)化生產(chǎn)中，如大蒜蒜酶中試生產(chǎn)[6]、果膠酶濃縮工藝[7]等，但是僅僅利用硫酸銨沉淀法對酶進行純化，酶活回收率較低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。本文先利用微濾除雜、超濾濃縮分離得菠蘿蛋白酶濃縮液，再結(jié)合硫酸銨沉淀法，建立一整套菠蘿蛋白酶工業(yè)化生產(chǎn)工藝。超濾膜濃縮后采用硫酸銨沉淀，可減少樣品體積，大大減少硫酸銨的用量，而硫酸銨沉淀得酶膏，可減少真空冷凍的干燥預(yù)冷和干燥時間，降低生產(chǎn)成本。通過方法的組合，優(yōu)化菠蘿莖蛋白酶提取工藝，得到純度和酶活回收率均高于原工廠酶的食品級用酶。同時，本文還對新工藝制得的酶的性質(zhì)進行了測定，以期證明采用該工藝得到的菠蘿蛋白酶能保持目前使用的菠蘿蛋白酶原有的性質(zhì)，且純化倍數(shù)和酶活回收率均較高，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。菠蘿蛋白酶分離提取技術(shù)的開發(fā)及其應(yīng)用，可提高菠蘿廢棄物的綜合利用價值，加快菠蘿蛋白酶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

菠蘿莖、原工廠酶 由湛江徐聞縣美侖生物制品有限公司提供；其它試劑 均為分析純。

752 型紫外可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；FD-1PF真空冷凍干燥機 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；Vivaflow 200超濾系統(tǒng)及其超濾離心管 Vivascience AG公司；ф1.6×80cm層析柱 上海嘉鵬科技有限公司；恒流泵、紫外檢測儀 上海清浦滬西儀器廠；MINI－PROTEANⅡ型電泳儀 Bio－RAD公司；日立UV-3010型紫外可見分光光度計日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 菠蘿莖→壓榨→原液→低速離心→清液→微濾→透過液→超濾→濃縮液→硫酸銨沉淀→酶膏→透析脫鹽→真空冷凍干燥→精制酶

1.2.2 工藝要點

1.2.2.1 壓榨 將菠蘿莖洗凈，用壓榨機壓出汁液，然后用紗布過濾。

1.2.2.2 離心和微濾 5000r/min離心10min，上清液采用0.22μm膜進行過濾，得淺黃色菠蘿莖蛋白酶清液。

1.2.2.3 超濾 參考王平諸[4]的方法。先將截留分子量10000u的中空纖維超濾膜用水洗0.5h→堿洗0.5h→水洗0.5h，用去離子水測水通量（J0），菠蘿莖清液經(jīng)5000r/min離心10min，0.22μm膜過濾后進行超濾濃縮，在泵提供的動力下，調(diào)節(jié)至固定流速，在一定操作溫度下，調(diào)節(jié)進出口壓力，溶液經(jīng)微濾后進入超濾膜中。反復(fù)循環(huán)，濃縮至體積約為原體積的1/10。結(jié)束后，用水循環(huán)洗滌超濾膜0.5h，再用堿洗0.5h，最后再用水洗滌至恢復(fù)原來的水通量。

1.2.2.4 硫酸銨沉淀法 一級沉淀：取適量濃縮液，加入適量的硫酸銨，使其飽和度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，于低溫下靜置0.5h。10000r/min離心5min，沉淀用與樣品等體積的0.02mol/L pH=7.0 PBS溶解，分別測定上清液和沉淀的酶活和蛋白含量，計算收率和純化倍數(shù)，確定分級沉淀的初始和最終飽和度。分級沉淀：取適量濃縮液，轉(zhuǎn)入離心管中，按一級沉淀得到的分級沉淀的初始和最終飽和度加入硫酸銨，使其分別達到分級沉淀硫酸銨初始和最終飽和度，于低溫下靜置0.5h，之后操作同一級沉淀，測定酶活和蛋白含量。

1.2.3 純化方法

1.2.3.1 Sephadex G-100層析 取適量酶粉溶于1mL 0.02mol/L pH=7.0 PBS緩沖液，10000r/min冷凍離心5min，取上清液通過SephadexG-100層析（1.6cm×60cm），用0.02mol/L pH=7.0 PBS緩沖液進行洗脫，洗脫液流速為0.5mL/min，分別測定酶活和蛋白A280，計算收率和純化倍數(shù)。

1.2.3.2 DEAE-52離子交換柱層析 取Sepadex G-100層析酶活管，混合，測定體積，低溫凍結(jié)，真空冷凍干燥后溶于1mL 0.02mol/L pH=7.0 PBS緩沖液，10000r/min冷凍離心5min，取上清液上柱（1.6cm×40cm）。采用梯度洗脫的方式，洗脫液A：0.02mol/L pH=7.0 PBS緩沖液，洗脫液B：0.02mol/L pH=7.0 PBS緩沖液（內(nèi)含0.5mol/L NaCl），各100mL，線性洗脫，洗脫液流速為1mL/min，測酶活和蛋白A280，計算收率和純化倍數(shù)。

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 蛋白質(zhì)含量的測定 參考裴顯慶[8]采用的考馬斯亮藍G-250法，以牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)蛋白，與Bradford試劑作用，用分光光度計在595nm處測定吸光度，樣品同樣處理，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測定并算得蛋白含量。

1.2.4.2 菠蘿莖蛋白酶酶活測定 參考施特爾馬赫[9]采用的酪蛋白法。1min內(nèi)酶水解酪蛋白釋放出相當(dāng)于1μg/mL酪氨酸在275nm波長處的吸收度為1個活力單位。

1.2.4.3 SDS-PAGE電泳 參考丁宵霖等[10]的方法，將蛋白質(zhì)樣品適量與5×上樣緩沖液（Loading Buffer）在離心管中混合，100℃加熱2～10min，8000r/min離心5min，用微量注射器將樣品20μL加入樣品孔中。采用濃縮膠75V，分離膠80～100V，電泳約2.5h，直到溴酚藍指示劑電泳到距膠邊緣1cm時停止電泳。小心取下凝膠，用考馬斯亮藍R-250染液染色30min，用考馬斯亮藍R-250脫色液脫色過夜，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 菠蘿莖蛋白酶濃縮液的制備

壓榨后的菠蘿莖蛋白酶原液需迅速過濾后放入-20℃保存，防止酶活力降低。提取前將處于-20℃保存的菠蘿莖蛋白酶原液解凍，5000r/min離心10min，以除去不溶性雜質(zhì)。上清液采用0.22μm膜進行預(yù)過濾，以除去微生物、一些大分子蛋白和多糖等膠體物質(zhì)，得淺黃色菠蘿莖蛋白酶清液。再將清液進行超濾濃縮，一方面溶液中的小分子物質(zhì)經(jīng)中空纖維膜的內(nèi)壁滲透出來成為超濾液而排出；另一方面，料液通過蠕動泵循環(huán)打入超濾膜，溶液中的酶蛋白等大分子物質(zhì)得以保留并得到濃縮。

2.2 硫酸銨鹽析法提取菠蘿莖蛋白酶

菠蘿蛋白酶是典型的巰基蛋白酶，是一種分子量為33000u的蛋白質(zhì)[9]。硫酸銨是強電解質(zhì)，有強烈的水化作用，可破壞蛋白質(zhì)顆粒表面的水化膜，并能中和蛋白質(zhì)顆粒所帶的電荷，使蛋白質(zhì)在溶液中凝聚而析出。但只有達到蛋白質(zhì)等電點時，其才易于沉淀，不同蛋白質(zhì)有不同等電點，即硫酸銨鹽析濃度不同，且不同蛋白質(zhì)硫酸銨鹽析的最佳次數(shù)不同[10]，因此，需對其進行硫酸銨一級沉淀和分級沉淀實驗。

2.2.1 硫酸銨一級沉淀結(jié)果 經(jīng)超濾濃縮后酶液進行硫酸銨一級沉淀，實驗結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 上清酶活收率和純化倍數(shù)的變化

由圖1可知，菠蘿莖蛋白酶濃縮液上清部分的酶活收率隨硫酸銨飽和度的增加呈現(xiàn)逐步下降的趨勢，當(dāng)硫酸銨的添加量達到70%時，上清的酶活收率為4.51%，上清已基本沒有酶活；當(dāng)硫酸銨濃度達到50%時，上清純化倍數(shù)達到最高值1.57倍，但酶活收率只有38.08%；硫酸銨添加濃度為20%時，上清酶活收率為90.42%，純化倍數(shù)為1.15倍。綜合考慮上清酶活收率和純化倍數(shù)，確定兩步沉淀的初始硫酸銨濃度為20%。

圖2 沉淀酶活收率和純化倍數(shù)的變化

由圖2可知，隨著硫酸銨濃度的增加，沉淀部分的酶活收率呈現(xiàn)逐步上升的趨勢，在硫酸銨濃度達到70%時，沉淀部分酶活收率達到最大值95.49%，隨后酶活收率趨于穩(wěn)定；就沉淀部分的純化倍數(shù)而言，10%、20%濃度硫酸銨所得沉淀的純化倍數(shù)較高，分別為2.29和1.58倍，但酶活收率分別只有10.70%和9.58%，30%～70%濃度硫酸銨所得沉淀的純化倍數(shù)均小于1，純化效果不好，而90%濃度硫酸銨沉淀的純化倍數(shù)相對較高，為1.43倍，酶活收率達94.21%。綜合考慮沉淀酶活收率和純化倍數(shù)，確定硫酸銨濃度為90%作為分級沉淀的終濃度。

2.2.2 硫酸銨分級沉淀結(jié)果 在一級沉淀確定的初濃度和終濃度下，進行硫酸銨分級沉淀，并與一級沉淀結(jié)果進行對比，實驗結(jié)果如表1所示。

由表1可知，采用20%～80%分級沉淀所得的酶活收率和純化倍數(shù)均比一級沉淀的低，而采用90%一級沉淀所得酶純化倍數(shù)最高，酶活收率僅降低0.36%。綜合考慮酶活收率和純化倍數(shù)，濃縮液一級沉淀使用90%硫酸銨所得結(jié)果最好。同時比較工廠精制酶，90%硫酸銨沉淀所得酶純度是工廠酶的1.19倍，該精制酶代表工廠目前生產(chǎn)的最高水平，因此本工藝提取的酶在純度上具有優(yōu)越性。

表1 硫酸銨沉淀結(jié)果

2.2.3 硫酸銨沉淀酶液的電泳結(jié)果 在進行了硫酸銨一級和分級沉淀確定最優(yōu)工藝后，為確定純化效果，進行了不同處理酶的電泳實驗，結(jié)果如圖3所示。

圖3 濃縮液硫酸銨沉淀電泳圖

由圖3可知，菠蘿莖原液中含有較多的雜蛋白；濃縮液80%和90%硫酸銨沉淀中，分子量大于目標(biāo)蛋白的雜帶已消失，分子量小于20ku的雜帶也明顯減少，這說明濃縮液經(jīng)過硫酸銨沉淀后純化效果明顯。從電泳圖上也可看出，濃縮液80%和90%硫酸銨沉淀所得酶純度較工廠精制酶高，主要表現(xiàn)為分子量小于20ku雜帶區(qū)域顏色較工廠精制酶淺，即該部分雜蛋白較少，說明采取濃縮后硫酸銨沉淀的方式確實使酶的純度得到提高。

2.3 菠蘿莖蛋白酶的純化

為研究菠蘿莖蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)，對其進一級分離純化，制備純酶。

2.3.1 Sephadex G-100柱層析純化菠蘿莖蛋白酶Sephadex G-100柱層析純化結(jié)果如圖4所示。

圖4 菠蘿莖蛋白酶Sephadex G-100柱層析圖譜

由圖4可知，采用Sepadex G-100柱層析后，得到3個蛋白峰，其中第二個蛋白峰具有酶活，而第一和第三個蛋白峰基本無酶活，說明菠蘿莖蛋白酶與其它雜蛋白已基本分開。

2.3.2 DEAE-52離子交換柱層析純化菠蘿莖蛋白酶Sepadex G-100柱層析的酶活管經(jīng)DEAE-52離子交換柱層析結(jié)果如圖5所示。

圖5 菠蘿莖蛋白酶DEAE-52離子交換柱層析圖譜

由圖5可知，經(jīng)DEAE-52離子交換柱層析后，菠蘿莖蛋白酶只有一個酶活峰和一個蛋白峰，說明已實現(xiàn)了菠蘿莖蛋白酶與其它雜蛋白分開。

2.3.3 SDS-PAGE電泳檢驗 經(jīng)DEAE-52離子交換柱層析制得菠蘿莖蛋白酶純酶，為進一步考察驗證酶分子的純度，進行了電泳實驗，實驗結(jié)果如圖6所示。

圖6 菠蘿莖蛋白酶純酶電泳圖

由圖6可知，經(jīng)純化后所得菠蘿莖蛋白酶純度較高，在5%濃縮膠、12%分離膠電泳中表現(xiàn)出一條帶，說明所得酶已達到電泳純。同時，以相對遷移率對log分子量作圖，求得菠蘿莖蛋白酶分子量為24.5ku。

2.4 菠蘿莖蛋白酶純化表

為比較不同工藝下制得菠蘿莖蛋白酶的優(yōu)劣，繪制了純化表，結(jié)果如表2所示。

表2 菠蘿莖蛋白酶純化表

由表2可知，隨純化倍數(shù)的提高，菠蘿莖蛋白酶的酶活收率逐步降低。與工廠現(xiàn)有工藝相比，采用超濾濃縮和硫酸銨沉淀相結(jié)合的提取方法，酶活收率和純化倍數(shù)均有較大提高，且工藝步驟相對簡便，成本較低，符合工業(yè)上提取高活力菠蘿蛋白酶的需要。而菠蘿莖蛋白酶經(jīng)Sephadex G-100柱層析和DEAE-52柱層析后，純化倍數(shù)大大提高，該酶分子已達到電泳純，雖經(jīng)過該處理酶活收率大大降低，最終只有約25%左右，但該生產(chǎn)工藝可滿足市場的不同需求，特別是醫(yī)藥用酶，因此若能將酶活收率的降低部分轉(zhuǎn)嫁到產(chǎn)品的成本上，提高產(chǎn)品的附加價值，也存在很好的市場應(yīng)用價值。

2.5 菠蘿莖蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.5.1 pH對菠蘿莖蛋白酶活力的影響 進行了不同pH體系酶活力實驗，結(jié)果如圖7所示。

圖7 菠蘿莖蛋白酶最適反應(yīng)pH

由圖7可知，菠蘿莖蛋白酶的最適反應(yīng)pH在5～6之間，為弱酸性，這與林文光[13]研究結(jié)果一致。當(dāng)pH小于5，即在較酸性環(huán)境下反應(yīng)速度迅速降低；當(dāng)pH＞6，隨著pH的增大，酶比活逐漸降低，相比酸性環(huán)境，在堿性環(huán)境中有一個較廣的適應(yīng)區(qū)間。

2.5.2 溫度對菠蘿莖蛋白酶活力的影響 進行了不同溫度下的酶活力實驗，結(jié)果如圖8所示。

圖8 菠蘿莖蛋白酶最適反應(yīng)溫度

由圖8可知，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶的比活逐漸增大，在60℃時達到最大值，即此溫度酶具有最大反應(yīng)速度，這與趙武玲等[14]和章佩芬[15]報道的菠蘿蛋白酶最適溫度在55～65℃之間的結(jié)果大體一致。隨后，當(dāng)溫度繼續(xù)升高，酶的比活逐漸降低，這主要是因為高溫會使酶的蛋白結(jié)構(gòu)受到破壞、變性，以致酶活變小甚至失活。酶在反應(yīng)中的最適溫度實際上是酶反應(yīng)速度與酶變性速度綜合影響的結(jié)果[16]。在實際應(yīng)用中，它與反應(yīng)時間的長短有關(guān)，反應(yīng)時間越長，測得的最適溫度會有所降低。由此可見，菠蘿莖蛋白酶的最適反應(yīng)溫度約為60℃。

2.5.3 金屬離子對菠蘿莖蛋白酶活力的影響 配制不同種類和濃度金屬離子進行實驗，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，重金屬離子如Cu2+、Fe2+、Pb2+等對菠蘿莖蛋白酶活抑制較大，且隨著濃度的增大迅速抑制酶活，這與易元龍[17]的研究結(jié)果一致；而Na+，K+，Ca2+則表現(xiàn)出不同程度的激活作用，這與P.Kaul，H.A.[18]等研究金屬離子對木瓜蛋白酶的影響所得結(jié)果相一致。重金屬離子對菠蘿莖蛋白酶酶活基本表現(xiàn)出一種抑制作用，這主要由于菠蘿蛋白酶是一種巰基蛋白酶，極易發(fā)生氧化反應(yīng)，而多數(shù)金屬離子又是氧化反應(yīng)的催化劑，或直接與巰基有螯合作用，從而使酶活降低。因此，在生產(chǎn)應(yīng)用過程中應(yīng)盡量避免與金屬離子接觸。

表3 金屬離子對菠蘿莖蛋白酶酶活的抑制率（%）

3 結(jié)論

研究中采用微濾除雜、超濾濃縮和硫酸銨沉淀等方法組合分離純化菠蘿蛋白酶，采用超濾方式進行濃縮，一方面可以減少酶液的體積、硫酸銨的用量，同時降低了其對產(chǎn)品純度的影響；另一方面，超濾也可達到一定純化酶的效果，除去原液中一些分子量比目標(biāo)酶小的分子。超濾濃縮法屬物理分離手段，低溫?zé)o相變，不易對酶活力產(chǎn)生影響。綜合考慮產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)的實際問題，在工廠生產(chǎn)制備精制酶時，推薦采用超濾濃縮結(jié)合90%硫酸銨沉淀的方式對菠蘿莖蛋白酶進行分離提取。

本實驗改良工藝制得的菠蘿蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)與有關(guān)報道的菠蘿蛋白酶基本一致，最適反應(yīng)pH在5～6之間，最適溫度60℃，重金屬離子如Cu2+、Fe2+、Pb2+等對菠蘿莖蛋白酶活抑制較大，而Na+、K+、Ca2+則表現(xiàn)出不同程度的激活作用。

若實際生產(chǎn)過程對酶純度要求非常高，特別是醫(yī)藥級別所需菠蘿莖蛋白酶純度較高，則需制備純酶。本實驗菠蘿莖蛋白酶經(jīng)Sephadex G-100柱層析和DEAE-52柱層析后，純化倍數(shù)大大提高，分別為原液的1.83倍和1.91倍，電泳實驗證實該酶分子達到電泳純。

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Study on improvement of industrial extraction of bromelain and its enzymology characterization

WANG Yan,ZHAO Li-chao,CHEN Jie-lan,LIU Xiao-juan,LIU Xin*

（College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China）

A industrial production process for extraction of bromelain was studied.First，the concentrate of bromelain was enriched from the pineapple stalks by the ways of microfiltration and ultrafiltration.And then，the enzyme extracts were precipitated by the ammonium sulfate precipitation.Last，the bromelain was dehydrated by the vacuum freeze drying.On the basis of these，the high purity of bromelain was produced by the Sephadex G-100 and DEAE-52 ion column chromatography and its characterization was studied.The results showed that after the front process，1.44-fold purified bromelain was achieved，which purity than the old process was 1.19 times.The high purity of bromelain that was produced by the Sephadex G-100 and DEAE-52 ion column chromatography could reach the electrophoresis pure.This purified bromelain can satisfy the demand in medical treatment field，so it had higher market value.And the result of the characterization of this bromelain was consistent with earlier reports.The optimum pH and temperature of the purified enzyme were 5～6 and 60℃.The purified enzyme was inhibition by heavy metal ions such as Cu2+，F(xiàn)e2+，Pb2+，and activation by the Na+，K+，Ca2+.

bromelain；extraction；purification；enzymology characterization

TS255.1

B

1002-0306（2011）10-0353-05

2010－10－08 * 通訊聯(lián)系人

王燕（1987－），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。