趙建云，馬會(huì)勤，肖 滿(mǎn)，左芳雷，陳尚武,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

氧氣脅迫對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌葡萄糖代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

趙建云1，馬會(huì)勤2，肖 滿(mǎn)1，左芳雷1，陳尚武1,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

雙歧桿菌對(duì)氧氣敏感，耐氧性成為其重要的性狀及研究?jī)?nèi)容之一。實(shí)驗(yàn)采用半定量RT-PCR法對(duì)在4%氧氣條件下培養(yǎng)的長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68的葡萄糖代謝中關(guān)鍵酶基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了比較和分析。結(jié)果表明，隨著氧氣濃度增加，長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68的生長(zhǎng)逐漸受到抑制，在4%濃度脅迫條件下，葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、磷酸酮醇酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶在氧脅迫30min時(shí)的mRNA表達(dá)明顯下降，60min及120min后，xfp和gap酶的mRNA表達(dá)量恢復(fù)到厭氧條件下的水平。研究了長(zhǎng)雙歧桿菌在氧氣脅迫下菌體生長(zhǎng)以及葡萄糖代謝中關(guān)鍵酶基因mRNA的變化情況，這些可能是細(xì)胞受到氧氣脅迫的應(yīng)激反應(yīng)之一，推測(cè)葡萄糖代謝酶與長(zhǎng)雙歧桿菌耐氧性有一定關(guān)聯(lián)。

長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68，耐氧性，葡萄糖代謝酶，半定量RT-PCR

益生菌需要保持很高的活菌數(shù)才能發(fā)揮其對(duì)于宿主的各種生理功能[1]，但由于外界環(huán)境因素會(huì)影響其活菌數(shù)，特別是在有氧條件下，雙歧桿菌會(huì)形成H2O2、O2-·、HO·等活性氧[2]，活性氧在細(xì)胞內(nèi)積累，會(huì)對(duì)細(xì)胞形成毒害作用，限制了其益生功能的發(fā)揮。不同菌株有不同程度的耐氧性[3]，有些菌株可經(jīng)人工耐氧馴化后提高自身耐氧能力[4]。雙歧桿菌耐氧性研究有利于保持雙歧桿菌制劑中較高的活菌量和其擴(kuò)大生產(chǎn)等實(shí)際應(yīng)用。人們已經(jīng)對(duì)于雙歧桿菌的耐氧機(jī)理進(jìn)行了一些探索與研究[5-6]，但主要集中在細(xì)胞水、分子水平研究，有待進(jìn)一步擴(kuò)展。已有的研究表明，氧氣會(huì)影響雙歧桿菌的糖代謝[7]。雙歧桿菌對(duì)葡萄糖的代謝是經(jīng)由特殊的雙歧支路代謝途徑[5]，其中果糖-6-磷酸解酮酶是雙歧桿菌特殊的支路代謝途徑中關(guān)鍵性酶（見(jiàn)圖1）。雙歧桿菌葡萄糖代謝酶的基因在環(huán)境脅迫下會(huì)發(fā)生表達(dá)量的變化[8-9]。研究氧氣脅迫下葡萄糖代謝途徑中代謝酶mRNA水平，能夠?qū)﹄p歧桿菌在有氧環(huán)境下的代謝與耐氧性的分子機(jī)制作進(jìn)一步的研究和探索，對(duì)于拓寬雙歧桿菌的應(yīng)用范圍具有深遠(yuǎn)意義。本研究對(duì)4%氧氣濃度條件下長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68中葡萄糖代謝關(guān)鍵酶基因的表達(dá)進(jìn)行了研究，旨在了解長(zhǎng)雙歧桿菌葡萄糖代謝中關(guān)鍵酶與耐氧性間的關(guān)系，探索長(zhǎng)雙歧桿菌耐低氧可能的分子機(jī)制,為雙歧桿菌益生菌株的篩選、改造和應(yīng)用提供基本研究材料，為進(jìn)一步從代謝水平上闡明長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)低氧脅迫的反應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

圖1 雙歧桿菌葡萄糖代謝途徑（主要途徑）

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

供試材料 長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68（Bifidobacterium longumBBMN68），由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選，中科院微生物所菌種保藏中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC2265；實(shí)驗(yàn)采用改造的MRS培養(yǎng)基（不加半胱氨酸鹽酸鹽），采用亨蓋特厭氧滾管及300mL膠塞密封瓶培養(yǎng)雙歧桿菌，培養(yǎng)基上方充入氮?dú)鈦?lái)保證厭氧條件；TRIZOL試劑 美國(guó)Invitrogen（上海）英俊生物技術(shù)有限公司；氯仿，異丙醇，無(wú)水乙醇，DEPC，反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（promega），DL2000DNAmarker TaKaRa公司，大連；引物合成 美國(guó)Invitrogen（上海）英駿生物技術(shù)有限公司完成；rTaq DNA聚合酶，DNase I RNasefree（TaKaRa） 大連寶生物工程有限公司；Random引物 TIANGEN。

低溫離心機(jī)，超凈工作臺(tái)，核酸分析儀，PCR儀，培清JS-680c全自動(dòng)凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；照相電泳儀、微量分光光度計(jì) GeneDrop?ND-1000，Gene Company Limited。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙歧桿菌培養(yǎng) 將冷凍保藏菌種，以1%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)18h，連續(xù)活化兩代作為種子培養(yǎng)液。B.longum BBMN68菌株在10mL培養(yǎng)基的亨蓋特厭氧管中厭氧培養(yǎng)，活化后的菌種按1%接菌量接入100mL培養(yǎng)基中（培養(yǎng)瓶總體積為300mL，充入氮?dú)夂笥妹芊饽z塞密封，滅菌），37℃培養(yǎng)至OD600nm為0.6時(shí)，設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組以4%（體積分?jǐn)?shù)）空氣注入，并與對(duì)照組同時(shí)放入搖床中100r/min分別培養(yǎng)30、60、120mim，離心收集菌體，液氮速凍，立即提取總RNA。

本文采用的是按比例向基質(zhì)中注入空氣，增加基質(zhì)上方氧分壓，進(jìn)而增加基質(zhì)中溶氧量的方法來(lái)進(jìn)行氧適應(yīng)[10]。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 PCR引物根據(jù)GenBank提供的相關(guān)序列（Genbank accession number NC_004567）采用Primer 5.0設(shè)計(jì)，并由美國(guó)Invitrogen（上海）英俊生物技術(shù)有限公司合成。實(shí)驗(yàn)所選各個(gè)基因引物序列及擴(kuò)增片段大小見(jiàn)表1。

1.2.3 長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將活化的菌種按1%接菌量接入100mL培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)，每隔2h取出3個(gè)培養(yǎng)瓶用分光光度計(jì)測(cè)量其600nm處的吸光度，以不含菌液的空白培養(yǎng)基管為空白，平行實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，以此作為對(duì)照組，同時(shí)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組，當(dāng)其培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期OD600nm為0.6左右時(shí)，用50mL注射器充入一定體積空氣，使培養(yǎng)瓶中氧氣體積占4%（體積分?jǐn)?shù)），于搖床中以100r/min的轉(zhuǎn)速37℃恒溫培養(yǎng)，同樣每隔2h取樣檢測(cè)，平行實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。最后以吸光度為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線（見(jiàn)圖2）。同時(shí)取樣進(jìn)行培養(yǎng)基pH的測(cè)定，并繪制pH變化曲線（見(jiàn)圖3）。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物名稱(chēng)及序列

1.2.4 總RNA提取及含量測(cè)定 總RNA提取采用Trizol法（Invetrogen，USA），具體操作按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

分別在厭氧生長(zhǎng)組和氧氣處理組的雙歧桿菌培養(yǎng)液中取樣。首先取10mL培養(yǎng)液放入離心管中進(jìn)行4℃離心，10000×g離心2min，然后棄去上清液，用緩沖液洗滌菌體，4℃離心，收集菌體，迅速加液氮冷凍。經(jīng)過(guò)裂解、分離、沉淀、洗滌及溶解步驟得到總RNA。

以不含RNase的DNase進(jìn)行RNA純化處理，消除RNA中可能帶有的DNA。消化后的RNA采用微量分光光度計(jì)（ND-1000，美國(guó)）測(cè)定純度及定量（OD260nm/OD280nm、OD260nm/OD230nm），1%瓊脂糖凝膠垂直電泳（120V，15min左右）鑒定RNA提取質(zhì)量，調(diào)整各樣總RNA濃度至100ng/μL。備用總RNA樣品冷存于-80℃中用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為20μL/管，反應(yīng)液的配制在冰上進(jìn)行，用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV反轉(zhuǎn)合成cDNA第一鏈。

反轉(zhuǎn)錄體系為：2μL RNA樣品和2μL隨機(jī)引物加在試管底部，70℃水浴10min，立即冰浴5min，離心，在冰上加入8μL RNase free ddH2O，4μL RT-Buffer，1μL RNA酶抑制劑，2μL超純dNTP，1μL反轉(zhuǎn)錄酶MMLV，離心，37℃反應(yīng)1h，95℃加熱滅酶5min，冰浴5min，RT產(chǎn)物測(cè)定含量后，放入-20℃環(huán)境下保存。

1.2.6 PCR反應(yīng)體系及產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，用自行設(shè)計(jì)的各個(gè)基因的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，其成分如下：2.5 μL 10×PCR buffer；2μL dNTP（2.5μmol·L-1）；上、下游特異性引物10μmol·L-1各1μL；0.25μL rTaq DNA聚合酶，1μL模板（cDNA-1），補(bǔ)ddH2O至25μL。10×PCR buffer、dNTP、rTaq DNA聚合酶均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1min，94℃變性30s，不同的基因在各自適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟认峦嘶?0s，72℃延伸30s，循環(huán)數(shù)（不同基因的最適循環(huán)數(shù)通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行選擇），72℃充分延伸10min，4℃，停止。

取每個(gè)樣品的目的基因RT-PCR產(chǎn)物5μL，同1μL上樣緩沖液混合均勻，分別點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠孔中，在另一孔中加入5μL DL2000 Marker，120V電壓下電泳20min左右。電泳結(jié)束后，使用培清JS-680c全自動(dòng)凝膠成像分析儀照相，并用儀器自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，測(cè)定不同培養(yǎng)條件下菌體中各個(gè)基因水平。用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行光密度比較分析，確定目的基因在組織樣品中表達(dá)量的相對(duì)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68生長(zhǎng)曲線

為了解長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68在不同氧氣濃度條件下的生長(zhǎng)情況，并以此來(lái)確定實(shí)驗(yàn)采用的氧氣脅迫濃度，實(shí)驗(yàn)測(cè)定了長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68分別在0、2%、4%和6%氧氣脅迫條件下不同時(shí)間的吸光值和pH，并繪制了生長(zhǎng)曲線及pH變化曲線（見(jiàn)圖3和圖4）。從圖中可以看出，長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68于2h時(shí)后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在14h時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期；2%～6%的氧氣濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)有影響，2%氧氣濃度影響生長(zhǎng)比較小，生長(zhǎng)曲線和無(wú)氧條件相似，但最高OD值小于厭氧培養(yǎng)的菌株，4%氧氣條件下，菌株首先進(jìn)入一個(gè)遲滯期，4h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在14h左右進(jìn)入平臺(tái)期；但最高OD值低于厭氧培養(yǎng)和2%氧氣濃度下生長(zhǎng)的菌株，6%的氧氣條件下雙歧桿菌處于停滯的狀態(tài)，生長(zhǎng)狀態(tài)基本保持不變。為了讓菌株既受到氧氣脅迫的影響，也不生長(zhǎng)停滯死亡，因此選擇4%氧氣濃度作為實(shí)驗(yàn)中氧氣脅迫長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68的氧氣濃度。

結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)基上方氧氣濃度的增加，長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68的生長(zhǎng)受到抑制增強(qiáng)，2%和4%氧氣條件下已表現(xiàn)這種趨勢(shì)，到6%氧氣條件時(shí)，BBMN68的生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈的抑制。雙歧桿菌在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些有機(jī)酸代謝產(chǎn)物[11]，這些物質(zhì)會(huì)使培養(yǎng)基的pH隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而降低，其生長(zhǎng)狀態(tài)越好，產(chǎn)生的有機(jī)酸代謝產(chǎn)物就越多。從圖3可以看出，隨著氧氣濃度的增加，pH降低的程度相應(yīng)減少，這說(shuō)明在適應(yīng)氧氣脅迫的同時(shí)，雙歧桿菌的生長(zhǎng)狀態(tài)發(fā)生了調(diào)整。

圖2 長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68在不同氧氣濃度條件下的生長(zhǎng)曲線圖

圖3 長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68在不同氧氣濃度條件下pH的變化曲線圖

2.2 長(zhǎng)雙歧桿菌葡萄糖代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)的半定量PCR檢測(cè)

2.2.1 半定量RT-PCR循環(huán)數(shù)的確定 在PCR擴(kuò)增對(duì)數(shù)期，模板量與擴(kuò)增產(chǎn)量成正比，而在PCR擴(kuò)增后期，其產(chǎn)量將不隨模板量的增加而增加。適宜循環(huán)次數(shù)的多少與cDNA鏈中該基因片段模板數(shù)量呈線性相關(guān)，與條帶的亮度呈指數(shù)相關(guān)。為了準(zhǔn)確反映不同培養(yǎng)條件下葡萄糖代謝酶基因表達(dá)，在進(jìn)行半定量PCR時(shí)，要求PCR擴(kuò)增不進(jìn)入平臺(tái)期。實(shí)驗(yàn)選取同一樣本cDNA，分別用所選葡萄糖代謝酶和16S rRNA的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行了24、26、28、30、32、34和36個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(見(jiàn)圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)葡萄糖代謝酶基因達(dá)到34循環(huán)時(shí)條帶的吸光值基本達(dá)到恒定。因此32循環(huán)被共同RT-PCR擴(kuò)增所采用。

圖4 長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68不同循環(huán)次數(shù)擴(kuò)增所選代謝酶、16SrRNA產(chǎn)物電泳

2.2.2 以16S為內(nèi)參基因?qū)ρ鯕饷{迫前后基因的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量驗(yàn)證。

2.2.2.1 內(nèi)參基因16S rRNA的表達(dá)水平 RT-PCR方法以?xún)?nèi)參基因（internal reference gene）的表達(dá)量對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)量進(jìn)行歸一化，對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)量化。

圖5 內(nèi)參基因16SrRNA在氧氣處理前后的電泳圖和表達(dá)量比較

對(duì)自行設(shè)計(jì)的16S rRNA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)到了預(yù)期大小的基因片段：184bp的16S rRNA基因片段（見(jiàn)圖5）。電泳圖片條帶清晰，無(wú)非特異性擴(kuò)增帶。為了進(jìn)一步對(duì)16S的表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證，取上述電泳條帶的灰度值進(jìn)行計(jì)算、作圖，見(jiàn)圖5?？梢钥闯龆邲](méi)有顯著性差異，16S rRNA的表達(dá)量在不同的菌體培養(yǎng)條件下一致，可以作為內(nèi)參基因。

2.2.2.2 對(duì)照組和氧氣脅迫下雙歧桿菌部分代謝基因的表達(dá) 為了確保PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，實(shí)驗(yàn)將PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行了克隆測(cè)序，其中目的基因各個(gè)代謝酶基因大小與預(yù)期的一致，參比基因16S rRNA為184bp（見(jiàn)圖5）。測(cè)序結(jié)果表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確為代謝酶基因片段。根據(jù)長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68的生長(zhǎng)曲線，實(shí)驗(yàn)確定在菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即在培養(yǎng)8h時(shí)回收菌體并提取總RNA。參照RT-PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以16S rRNA作為看家基因，檢測(cè)長(zhǎng)雙歧桿菌中關(guān)于葡萄糖代謝中的6個(gè)關(guān)鍵酶基因（tal、pgm、gpi、tkt、xfp、gap）。在4%氧氣濃度處理30、60、120min后的表達(dá)情況。圖6是在氧氣脅迫下以上各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)情況。按照半定量RT-PCR的要求，樣品采用三次重復(fù)。根據(jù)16S rRNA內(nèi)參基因調(diào)整的體系擴(kuò)增選定基因。對(duì)4%氧氣脅迫下30、60、120min的所選基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，用所選基因與16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的比值來(lái)表示各個(gè)所選基因在氧脅迫下的變化趨勢(shì)（見(jiàn)圖6）。由圖6可見(jiàn)，長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68在對(duì)數(shù)中期受氧氣脅迫后，各個(gè)代謝酶隨時(shí)間延長(zhǎng)，其RNA的表達(dá)都呈下降趨勢(shì)，在氧氣脅迫30min的時(shí)候表現(xiàn)最明顯，隨著氧氣脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，雙歧桿菌代謝酶mRNA的水平又有所回升，如xfp、tkt和gap。這些基因編碼的蛋白酶對(duì)菌株生長(zhǎng)起關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映了長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68葡糖糖代謝關(guān)鍵酶同細(xì)胞受氧氣脅迫反應(yīng)的相互關(guān)系，從長(zhǎng)雙歧桿菌葡萄糖代謝的角度來(lái)看，長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68短時(shí)適應(yīng)低氧壓力的原因，可能是葡萄糖代謝中關(guān)鍵酶的變化。

圖6 代謝酶基因擴(kuò)增電泳圖和氧氣脅迫前后基因的表達(dá)量變化

3 討論

有氧條件下，雙歧桿菌會(huì)形成H2O2、O2-·、HO·等活性氧[6]。活性氧能夠擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)，并氧化破壞細(xì)胞內(nèi)的重要物質(zhì)，如：細(xì)胞膜脂質(zhì)、酶和DNA[12-14]。雙歧桿菌耐氧性是其重要的研究?jī)?nèi)容之一，多年來(lái)，許多研究者致力于雙歧桿菌的耐氧性能及其機(jī)制的研究，基本都是從細(xì)胞水平上闡明雙歧桿菌的耐氧機(jī)制。Kawasaki S[6]發(fā)現(xiàn)B.boumJCM 1211T和B.thermophilumJCM 1207T能夠在含20%氧氣的環(huán)境下生長(zhǎng)。Li Qingqing[3]分離鑒定了一株耐氧的雙歧桿菌Bifidobacterium animalis subsp.lactisQq08，比已商業(yè)化的菌株Bifidobacterium lactisBb12更具有優(yōu)良性能。Shimamura等建立了幾種雙歧桿菌對(duì)于氧氣敏感度的生化機(jī)制，得出結(jié)論認(rèn)為NADH氧化酶和NADH過(guò)氧化物酶在阻止氧氣毒害中起著重要的作用[15]。Talwalkar等[10]研究表明，不同的氧氣濃度促使雙歧桿菌的NADH氧化酶活力提高1.5～3倍，NADH過(guò)氧化物酶活力提高1.5～2倍，可能是由于氧氣誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的NADH氧化酶和NADH過(guò)氧化物酶，以便抵制氧的毒性作用。在氧化應(yīng)激條件下，細(xì)胞會(huì)激活許多蛋白質(zhì)的合成，即發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。合成的蛋白質(zhì)能夠應(yīng)付氧化應(yīng)激的破壞作用，進(jìn)而提高細(xì)胞抵制氧化應(yīng)激能力。Schell等[16]對(duì)B.longumNCC2705的基因組序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了三種可能與雙歧桿菌耐氧性有關(guān)的酶基因：巰基過(guò)氧化物酶基因、烷基過(guò)氧化物酶基因（ahpC）和肽蛋氨酸亞砜還原酶基因，這些酶能夠抵制活性氧對(duì)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化破壞。

雙歧桿菌對(duì)葡萄糖的代謝途徑不同于乳酸菌的同型或異型發(fā)酵，而是經(jīng)由特殊的雙歧支路代謝途徑，在氧適應(yīng)條件下，雙歧桿菌的部分性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化，糖代謝中的部分基因的表達(dá)量在酸性、膽鹽等應(yīng)激反應(yīng)中都會(huì)有變化，其中果糖-6-磷酸磷酸酮酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的表達(dá)在各種應(yīng)激反應(yīng)中都有降低的變化[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)有氧條件下長(zhǎng)雙歧桿菌BBN68中葡萄糖在雙歧支路代謝中的代謝酶基因表達(dá)的研究表明，隨著培養(yǎng)基上方氧氣濃度的增加，長(zhǎng)雙歧桿菌BBN68中葡萄糖代謝酶（包括果糖-6-磷酸磷酸酮酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的mRNA）的表達(dá)水平呈明顯的下降趨勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了更長(zhǎng)時(shí)間的脅迫，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，果糖-6-磷酸磷酸酮酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶等代謝酶的mRNA水平又能恢復(fù)，即經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的氧氣脅迫后菌株還是可以生長(zhǎng)的，暗示著雙歧桿菌細(xì)胞體內(nèi)有消除氧氣危害的機(jī)理，這種機(jī)制可能和代謝酶之間有關(guān)系。說(shuō)明在長(zhǎng)雙歧桿菌中，其葡萄糖代謝酶的活性是隨著培養(yǎng)環(huán)境中氧氣的增加而降低的，從而暗示了代謝酶的存在有利于長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68在有氧條件下的生長(zhǎng)，從葡萄糖代謝關(guān)鍵酶的mRNA水平說(shuō)明了氧氣對(duì)于雙歧桿菌的生長(zhǎng)及部分酶表達(dá)的變化的影響作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人在雙歧桿菌與其他研究所做的環(huán)境脅迫下糖代謝酶表達(dá)變化結(jié)果相一致[8-9]，在環(huán)境的脅迫下，雙歧桿菌葡萄糖在雙歧支路途徑中的代謝酶的表達(dá)都有下降的趨勢(shì)?？梢酝茰y(cè)，在長(zhǎng)雙歧桿菌中糖代謝部分酶與其耐氧性是有一定關(guān)聯(lián)的。細(xì)胞受到氧氣的毒害后，生長(zhǎng)緩慢以適應(yīng)不利環(huán)境，同時(shí)啟動(dòng)雙歧桿菌氧應(yīng)激反應(yīng)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，氧毒害減輕，細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)。至于啟動(dòng)什么氧應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。本文葡萄糖代謝關(guān)鍵酶的mRNA水平的變化可能是氧應(yīng)激反應(yīng)中的一種。

半定量RT-PCR是基于基因轉(zhuǎn)錄mRNA水平對(duì)基因表達(dá)的檢測(cè)，影響PCR的因素較多，本實(shí)驗(yàn)用半定量PCR進(jìn)行了4%氧氣不同時(shí)間的脅迫對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68葡萄糖代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響研究，說(shuō)明了代謝酶與氧氣脅迫之間可能存在的關(guān)系，隨著菌株培養(yǎng)環(huán)境中氧氣含量的變化，葡萄糖在雙歧支路代謝途徑中的部分代謝酶的表達(dá)也發(fā)生了變化，可以推測(cè)這些變化的酶和雙歧桿菌本身的抵抗氧氣的機(jī)制有著密切關(guān)系。實(shí)驗(yàn)只是進(jìn)行了一個(gè)氧氣濃度4%不同時(shí)間的脅迫，為了更進(jìn)一步探討氧氣脅迫與代謝酶之間的關(guān)系，說(shuō)明長(zhǎng)雙歧桿菌的耐氧分子機(jī)制，在此實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們還準(zhǔn)備進(jìn)行不同氧氣濃度各個(gè)時(shí)期不同時(shí)間的脅迫，準(zhǔn)備采用蛋白質(zhì)雙向電泳（2D-PAGE）、熒光差異凝膠電泳（2DDIGE）等手段對(duì)差異蛋白基因表達(dá)進(jìn)行研究，我們計(jì)劃在以后的實(shí)驗(yàn)中采用基因敲除、RNA干擾等技術(shù)，為進(jìn)一步確定葡萄糖代謝酶與長(zhǎng)雙歧桿菌耐氧性能之間的關(guān)系，深入闡明長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68在有氧條件下存活可能的分子機(jī)理，為乳酸菌益生菌株的篩選、遺傳改造和應(yīng)用提供基本研究數(shù)據(jù)。

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Expression of key enzymes in glucose metabolism associated with oxygen condition in bifidobacterium longum BBMN68

ZHAO Jian-yun1,MA Hui-qin2,XIAO Man1,ZUO Fang-lei1,CHEN Shang-wu1,*

（1.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China；2.College of Agriculture and Biotechnology,China Agricultural University,Beijing 100193,China）

Bifidobacteria is a kind of anaerobic bacteria，the ability of oxygen tolerance is one of the most important properties of Bifidobacteria.To investigate the genes expression of glucose of Bifidobacterium Longum BBMN68 which incubated in different oxygen condition，a semi-quantitative RT-PCR method was used to detect the key enzyme genes expression in 4%oxygen condition.The results indicated that the growth of Bifidobacterium Longum BBMN68 had been restrained by the oxygen stress，the mRNA level of the enzymes was depressed under 4%oxygen condition for 30 minutes，however，the mRNA level of xfp and gap had recovered under 4%oxygen condition for 60 minutes and more.Maybe it had some relationship between glucose metabolism enzymes and the growth ability of Bifidobacterium Longum BBMN68 in oxygen condition.

BifidobacteriumLongumBBMN68；oxygentolerance；glucosemetabolismenzymes；semi-quantitative RT-PCR

Q786

A

1002-0306（2011）10-0220-06

2010－10－20 * 通訊聯(lián)系人

趙建云（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物。

國(guó)家自然科學(xué)基金支持項(xiàng)目（31071507）。