馬利華，秦衛(wèi)東，陳學(xué)紅

（徐州工程學(xué)院食品學(xué)院，江蘇徐州 221008）

不同菌種制備大豆多肽的抗氧化活性比較研究

馬利華，秦衛(wèi)東，陳學(xué)紅

（徐州工程學(xué)院食品學(xué)院，江蘇徐州 221008）

分別采用枯草芽孢桿菌、啤酒酵母菌以及黑曲霉菌發(fā)酵豆粕制備多肽，利用SephadexG-15凝膠過濾層析、SDS-PAGE電泳等方法進(jìn)一步純化，并對(duì)各組分進(jìn)行抗氧化能力的研究。結(jié)果表明：采用枯草芽孢桿菌、啤酒酵母菌以及黑曲霉菌發(fā)酵豆粕得到多肽分別為13.512、12.462、14.752mg/mL。通過SephadexG-15凝膠過濾層析分別得到的組分Ⅰ分子質(zhì)量范圍分布在1055.67、1374.16、675.58u，組分Ⅱ分子質(zhì)量范圍分布在2031.49、2283.46、1625.54u。黑曲霉菌制備多肽原液及各組分清除3種自由基的作用較強(qiáng)，且組分1的清除效果好于組分2，其中對(duì)脂質(zhì)過氧化物清除能力大于TBHQ，并與VC相當(dāng)。

微生物，大豆，多肽，抗氧化性

微生物發(fā)酵法是將蛋白酶的發(fā)酵生產(chǎn)和大豆肽的酶解生產(chǎn)有機(jī)地結(jié)合在一起，降低大豆肽的生產(chǎn)成本，克服了酶水解法制備大豆肽產(chǎn)品的苦味大和口感差等缺點(diǎn)，同時(shí)由于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)大豆肽反應(yīng)條件溫和[1]，發(fā)酵豆粕后所得小肽所含的必需氨基酸與大豆蛋白質(zhì)中必需氨基酸相比含量更加豐富、營(yíng)養(yǎng)性更加平衡，且生理結(jié)構(gòu)與大豆蛋白相比更加獨(dú)特，比大豆蛋白更有營(yíng)養(yǎng)。因此，利用微生物發(fā)酵法制備活性肽成為研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。萬琦等[2-3]研究了大豆多肽生產(chǎn)菌株的篩選，得到了一株能在發(fā)酵過程中產(chǎn)蛋白酶的枯草芽孢桿菌，并研究了其發(fā)酵大豆多肽的條件優(yōu)化。李理等[4]用毛霉發(fā)酵大豆蛋白制備多肽，經(jīng)24～30h發(fā)酵水解度達(dá)到25%～30%，多肽得率高達(dá)75%。邵偉等[5]報(bào)道了以豆粕粉為原料添加枯草桿菌將大豆蛋白水解為大豆多肽。張智等人[6]用Bacillus subtilis發(fā)酵生產(chǎn)玉米多肽，玉米肽得率達(dá)到最大為82.7%。各級(jí)分的相對(duì)分子質(zhì)量分別大致為5128、3715和1513u。李善仁等[7]用芽孢桿菌和米曲霉混合菌固態(tài)發(fā)酵豆粕，大豆肽的得率為51%。陳學(xué)紅等[8]以芝麻粕為原料接種枯草芽孢桿菌發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時(shí)間為48h所得發(fā)酵液中芝麻多肽的質(zhì)量濃度達(dá)到3.585mg/mL。周建新等人[9]報(bào)道了Actinomucor elegans固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)菜籽肽工藝條件研究。龐宗文等人[10]毛霉發(fā)酵豆粕的提取物的大豆肽分子量集中在10ku以下。柳杰等人[11]報(bào)道了枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵制備花生抗氧化肽的研究。本實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌、啤酒酵母和黑曲霉為發(fā)酵菌種，液態(tài)發(fā)酵豆粕制備大豆抗氧化多肽，比較分析不同菌種制備大豆多肽的差別，旨在提高豆粕的利用率，為制備高質(zhì)量的豆粕功能肽提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆粕 新沂明帝食品有限公司提供；枯草孢桿菌（Bacillus subtil）i、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger） 本院食品與生物實(shí)驗(yàn)中心提供；DPPH 生化試劑，SIGMA公司；標(biāo)準(zhǔn)品牛血清白蛋白（Mw67000u）、溶菌酶（Mw14400u）、短菌肽（Mw1422.7u）、L-精氨酸（Mw174.2u） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；培養(yǎng)基 啤酒酵母培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基，黑曲霉培養(yǎng)基，PDA固體培養(yǎng)基。

DHG9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、7230G型可見分光光度計(jì)、精密酸度計(jì)PHS-3CA 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；DYY-12型電泳儀 北京市六一儀器廠；CX-1型層析譜數(shù)據(jù)分析系統(tǒng) 上海嘉鵬科技有限公司；小試平板超濾膜設(shè)備FlowMem0250 廈門世達(dá)膜科技有限公司；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 大豆多肽液的制備

枯草芽孢桿菌在發(fā)酵液pH為7.0，發(fā)酵溫度為36℃，轉(zhuǎn)速120r/min，接種量為5%（2.4×107cfu/mL），底物濃度即豆粕量為5%（W/V）的條件下培養(yǎng)32h，離心，上清液在80℃的水浴中滅活10min，測(cè)定多肽含量。

啤酒酵母菌在發(fā)酵液pH為7.0，發(fā)酵溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為120r/min，接種量為7%（1.68×108cfu/mL）的條件下，底物濃度即豆粕量為9%（W/V）培養(yǎng)24h，離心，上清液在80℃的水浴中滅活10min，測(cè)定多肽含量。

黑曲霉菌在發(fā)酵液pH為7.0，培養(yǎng)溫度37℃，接種量為2%（3.2×107cfu/mL），轉(zhuǎn)速為120r/min，底物濃度為即豆粕量為9%（W/V）的條件下培養(yǎng)32h，離心，上清液在80℃的水浴中滅活10min，測(cè)定多肽含量。

將上述得到的各大豆多肽發(fā)酵液用超濾膜（COWM 5000u）超濾純化。開啟超濾裝置，運(yùn)行一段時(shí)間，待整個(gè)系統(tǒng)穩(wěn)定后，在0.08MPa操作壓力、料液溫度為室溫、膜面積為0.1m2的條件下，對(duì)大豆多肽提取液進(jìn)行超濾純化。

1.3 Sephadex G-15凝膠層析法分離大豆多肽[12]

使用層析譜分析系統(tǒng)，對(duì)超濾純化后大豆多肽進(jìn)行柱層析純化。以0.5mL上樣體積，流速為15mL/h，洗脫液為蒸餾水，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為280nm。

1.4 大豆多肽分子量的確定方法[13]

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)（lgMr）為縱坐標(biāo)，相對(duì)遷移距離為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。根據(jù)樣品蛋白質(zhì)分子的相對(duì)遷移距離（蛋白質(zhì)分子遷移距離cm/染料遷移距離cm），由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到大豆多肽的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.5 大豆多肽含量計(jì)算

采用雙縮脲法[14]，回歸方程為：Y=0.1259X+0.0137，相關(guān)系數(shù)R2=0.9962，蛋白質(zhì)濃度在0～3.6mg/mL時(shí)，吸光度值呈良好線性。

1.6 抗氧化活性測(cè)定

1.6.1 DPPH·清除作用 參照文獻(xiàn)[15]。

1.6.2 ·OH清除作用 采用鄰菲羅啉法[16]。

1.6.3 脂質(zhì)過氧化物抑制作用 參照文獻(xiàn)[17]。

1.6.4 各種抗氧化體系的IC50值的確定 根據(jù)1.6.1～1.6.3的結(jié)果，用最小二乘法求得回歸方程，由回歸方程計(jì)算各抗氧化體系的IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種制備大豆多肽的含量

發(fā)酵是利用微生物體的代謝作用并借助于對(duì)代謝過程的控制來獲得所需產(chǎn)品的過程。利用微生物發(fā)酵來產(chǎn)大豆多肽主要利用的是發(fā)酵菌株的產(chǎn)酶及酶解能力。通常是以大豆蛋白為底物，以能在生長(zhǎng)代謝過程中大量分泌胞外蛋白酶的菌株為發(fā)酵菌株，在發(fā)酵過程中利用微生物所產(chǎn)蛋白酶的作用，將原料中的大豆蛋白水解，控制水解的進(jìn)程，便可得到具有特定鏈長(zhǎng)和對(duì)應(yīng)功能的大豆多肽。許多豆制品、乳制品的發(fā)酵就是基于這一原理[18]。本實(shí)驗(yàn)分別以枯草芽孢桿菌、黑曲霉菌、啤酒酵母菌為發(fā)酵菌株，發(fā)酵豆粕制備出多肽，結(jié)果表明，不同菌種的產(chǎn)酶及酶解能力不同，黑曲霉菌發(fā)酵豆粕制備多肽含量高于枯草芽孢桿菌和啤酒酵母菌，分別高出9.12%、18.38%。

2.2 不同菌種Sephadex G-15凝膠層析法分離結(jié)果

不同菌種凝膠層析分離結(jié)果見圖2。

2.3 抗氧化性

2.3.1 清除DPPH自由基能力測(cè)定 DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，與抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)，提供H+被還原，顏色發(fā)生變化，由深紫色變?yōu)榈S色。利用DPPH的溶液特征紫紅色團(tuán)的吸收峰，用分光光度法測(cè)定加抗氧化劑提取液后在波長(zhǎng)517nm處吸收的下降表示其對(duì)自由基的清除能力。

結(jié)果表明（見圖3），三種菌種制備的豆粕多肽及各組分清除DPPH自由基活性與其質(zhì)量均呈良好的線性關(guān)系，通過比較IC50可以看出黑曲霉菌制備的豆粕多肽無論發(fā)酵原液還是2個(gè)組分，其清除DPPH自由基能力均好于其他菌種制備的豆粕多肽，且其組分1的清除能力與TBHQ相當(dāng)。

圖2 不同菌種發(fā)酵豆粕多肽Sephadex G-15凝膠層析結(jié)果

圖3 不同菌種豆粕多肽清除DPPH·IC50的比較

2.3.2 清除OH自由基能力的測(cè)定 用比色分析法測(cè)定Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生的·OH，其中鄰菲羅啉-Fe2+是該反應(yīng)中的一種常用的氧化還原指示劑，其顏色變化可敏銳地反映溶液氧化還原狀態(tài)的改變，如果向反應(yīng)加入·OH的清除劑，則·OH減少，同時(shí)Fe2+增多，溶液顏色變紅，由此可推算·OH的清除劑對(duì)·OH的清除效率。

圖4 不同菌種發(fā)酵豆粕多肽清除OH自由基IC50比較

結(jié)果表明（見圖4），三種菌種制備的豆粕多肽及各組分清除OH自由基活性與其質(zhì)量均呈良好的線性關(guān)系，通過比較IC50可以看出黑曲霉菌制備的豆粕多肽無論發(fā)酵原液還是2個(gè)組分，其清除OH自由基能力均好于其他菌種制備的豆粕多肽，且其發(fā)酵原液清除能力好于VC、TBHQ，組分1和組分2的清除能力與TBHQ相當(dāng)。2.3.3 清除脂質(zhì)過氧化物自由基的效果 油脂發(fā)生氧化酸敗最終形成過氧化物丙二醛（MDN），TBA（硫代巴比妥酸）能與丙二醛在一定條件下反應(yīng)生成粉紅色物質(zhì)，這種粉紅的物質(zhì)在532nm有最大吸收峰，這種物質(zhì)的濃度與顏色成正比。因此，在特定波長(zhǎng)下，測(cè)定粉紅色物質(zhì)的含量即可得知過氧化物丙二醛的含量。油脂中添加抗氧化劑，可使油脂的氧化酸敗過程受到阻止或延緩，生成的丙二醛的含量就會(huì)降低，因而測(cè)定粉紅色物質(zhì)的含量也就降低。所以，通過在一定條件下測(cè)得TBA與丙二醛的生成物的含量即可推斷抗氧化劑的性能。

圖5 不同菌種豆粕多肽清除脂質(zhì)過氧化物自由基IC50的比較

結(jié)果表明（見圖5），三種菌種制備的豆粕多肽及各組分清除OH自由基活性與其質(zhì)量均呈良好的線性關(guān)系，通過比較IC50可以看出黑曲霉菌制備的豆粕多肽無論發(fā)酵原液還是2個(gè)組分，其清除OH自由基能力均好于其他菌種制備的豆粕多肽，且其發(fā)酵原液清除能力好于VC、TBHQ，組分1清除能力好于TBHQ，與VC相當(dāng)，組分2的清除能力好于TBHQ。

2.4 豆粕多肽分子質(zhì)量

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)（lgMr）為縱坐標(biāo)，相對(duì)遷移距離為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，經(jīng)回歸計(jì)算得回歸方程為：y=-1.2705x+4.9897（R2=0.9902）。由此，得到不同菌種制備的豆粕多肽的各個(gè)組分的分子質(zhì)量分別為：組分Ⅰ分子質(zhì)量范圍分布在1055.67、1374.16、675.58u，組分Ⅱ分子質(zhì)量范圍分布在2031.49、2283.46、1625.54u。

3 討論

微生物的內(nèi)源酶中存在著廣泛的肽酶譜系，通過微生物生命活動(dòng)中產(chǎn)酶將大豆蛋白降解為大豆肽并對(duì)某些基團(tuán)進(jìn)行修飾和重組，使小肽之間、小肽與氨基酸之間發(fā)生移接、重排，以改善大豆多肽的功能特性和加工特性[19]。菌種的選擇對(duì)發(fā)酵效果有至關(guān)重要的作用，各菌種都有其獨(dú)特的生理特性，它們的作用千差萬別，同樣，由于不同菌種生長(zhǎng)繁殖環(huán)境不同，不同菌株發(fā)酵的最優(yōu)條件也就不同。目前常用的菌種是乳酸菌、酵母菌、曲霉菌、產(chǎn)朊假絲酵母和枯草芽孢桿菌等[20-21]。吳勝華等[22]研究了從12株酵母菌中篩選出一株優(yōu)質(zhì)酵母菌，以普通生豆粕為原料，研究其對(duì)豆粕中胰蛋白酶抑制因子和小肽含量的影響，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。姜曼等[23]等以豆粕為原料，采用黑曲霉、米曲霉混合菌種固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)大豆肽，制得的大豆肽具有較好的理化特性和生理活性。

本研究確認(rèn)各菌種發(fā)酵得到的大豆肽均有良好的抗氧化性能，其中黑曲霉發(fā)酵大豆肽的抗氧化性能最好。另外，組分Ⅰ的抗氧化活性要強(qiáng)于組分Ⅱ（圖5）。Hsu、Lu和Jao[24]報(bào)道了用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）產(chǎn)生的orientase水解金槍魚煮汁得到的肽具有良好的抗氧化活性，其中活性最高的三種肽，分子量是分別為1305、938、584u的10肽、7肽和4肽。柳杰等人[11]指出，花生粕的枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中2～6個(gè)氨基酸組成的短肽比例較高是發(fā)酵液具有較強(qiáng)的DPPH·清除率的原因所在。這與本研究結(jié)果分子量較?。ǎ?000Da）時(shí)具有較高的抗氧化活性相一致。

本實(shí)驗(yàn)中各種菌種發(fā)酵的大豆肽清除DPPH·的IC50分別為0.887、2.562、0.614mg/mL，這與鞠興榮等人[25]的結(jié)果基本相似。他們確認(rèn)枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵制備的菜籽肽對(duì)DPPH·自由基的IC50為328μg/mL。與VC相比的結(jié)果與龐宗文等人報(bào)道的毛霉發(fā)酵豆粕產(chǎn)生的大豆肽清除DPPH·的能力約為VC60%的結(jié)果并不相同，這可能是由于在發(fā)酵的過程中，不同的菌種所產(chǎn)生的蛋白酶不同，切割大豆蛋白的位點(diǎn)不同，因此所得的大豆肽的分子量分布也不同的緣故。

4 結(jié)論

4.1 不同菌種發(fā)酵制備豆粕多肽含量分別為13.512、12.462、14.752mg/mL，其中黑曲霉菌制備的豆粕多肽含量高于其他2個(gè)菌種。

4.2 SephadexG-15凝膠層析分離不同菌種豆粕多肽發(fā)酵液，在洗脫速度在15mL/min，緩沖溶液為蒸餾水時(shí)，均分別得到2個(gè)組分。

4.3 SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示：不同菌種豆粕多肽發(fā)酵液經(jīng)層析后組分Ⅰ分子質(zhì)量范圍分布在1055.67、1374.16、675.58u，組分Ⅱ分子質(zhì)量范圍分布在2031.49、2283.46、1625.54u。

4.4 以清除DPPH自由基和羥自由基活性及對(duì)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物的抑制作用等方法測(cè)定不同菌種發(fā)酵大豆多肽的抗氧化活性。結(jié)果表明：不同菌種發(fā)酵豆粕多肽均有一定的抗氧化活性，且大豆多肽的3種抗氧化活性與其質(zhì)量均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。黑曲霉菌制備多肽原液及各組分清除3種自由基的作用較強(qiáng)，且組分1的清除效果好于組分2，其中對(duì)脂質(zhì)過氧化物清除能力大于TBHQ，并與VC相當(dāng)。

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Comparative study on antioxidative activities of soybean peptide produced by different microbiological strains

MA Li-hua,QIN Wei-dong,CHEN Xue-hong

（Food School of Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou 221008，China）

Soybean peptides were prepared byBacillus subtili，Saccharomyces cerevisiaeandAspergillus niger.The Sephadex G-15 gel filtration chromatograph and SDS-PAGE electrophoresis were used for purifying the peptides.Antioxidative activities of the each peptide components obtained by purity were analyzed.The results indicated that content of the peptide produced byBacillus subtili，Saccharomyces cerevisiaeandAspergillus nigerwere 13.512，12.462，14.752mg/mL，respectively.The peptides was separated into two contents by Sephadex G-15 gel filtration chromatograph.The relative molarcular weight of first componentforBacillus subtili，Saccharomyces cerevisiaeandAspergillus nigerwere 1055.67，1374.16，675.58u，respectively，and that of second component were 2031.49，2283.46，1625.54u，respectively.The peptide solution prepared byAspergillus nigerhad the most high scavenging capacities for DPPH·，hydroxy free radical as well as lipid peroxide free radicals among all peptides prepared by three microorganism strains，moreover first component was more stronger than second component.The scavenging capacities for lipid peroxide free radicals of peptide byAspergillus nigerwas stronger than TBHQ and the effect was corresponded with Vc.

microorganism；soybean；peptide；antioxidative activities

TS201.2

A

1002-0306（2011）10-0201-04

2011－08－02

馬利華（1966-），女，碩士，副教授，研究方向：食品加工。