黃曼曼，陳雪香，肖蘇堯，林健輝，黃偉華，曹 庸

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510640）

西藏開菲爾中抑菌活性物質(zhì)的提取及抑菌效果研究

黃曼曼，陳雪香，肖蘇堯，林健輝，黃偉華，曹 庸﹡

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510640）

采用水提取西藏開菲爾（Kefir）中的抑菌活性成分，用K-B紙片法測(cè)定提取物對(duì)常見的革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌、部分真菌和霉菌的抑菌活性，并檢測(cè)了用不同的pH、溫度、光照處理后提取物的抑菌效果。研究結(jié)果表明，Kefir提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌、黃曲霉和啤酒酵母均有明顯的抑制效果，最小抑菌濃度（MIC）在6.25～12.5mg/mL之間，與尼生素相比，抑菌效果相當(dāng)，抑菌譜更廣；提取物在酸性和中性條件下抑菌活性穩(wěn)定，而在堿性條件下抑菌活性減弱，且具有較好的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性。

西藏開菲爾，提取物，抑菌效果

Kefir是以由多種微生物組成的開菲爾粒作為發(fā)酵劑，發(fā)酵乳品而成的飲料，開菲爾粒的復(fù)雜共生體使得其具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和特殊的保健特性[1]。Kefir的研究始于20世紀(jì)九十年代。研究證明，不同地區(qū)的開菲爾，由于其發(fā)酵開菲爾粒菌相不同，其產(chǎn)物和特性也有不同[4]。西藏Kefir（藏靈菇）是我國(guó)西藏地區(qū)人民常年大量飲用的一種發(fā)酵飲品，不需進(jìn)行低溫及防腐處理，與市售發(fā)酵乳的保存方式相差很大。周劍忠等[5]研究了西藏Kefir的發(fā)酵特性；劉慧等[6]研究了藏靈菇中嗜熱鏈球菌高產(chǎn)胞外多糖；陶應(yīng)龍等[7]發(fā)現(xiàn)服用藏靈菇培養(yǎng)液對(duì)高脂血癥患者血脂中的膽固醇有一定的降低作用；李永奇[8]等證明了西藏Kefir對(duì)治療慢性腸道疾病有一定的調(diào)節(jié)作用；Simova等[2]通過提取、分離、純化手段從Kefir中提取到高效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌等微生物的小分子抑菌多肽；Sarkar等證明了Kefir提取物對(duì)傷口愈合的作用大于新霉素[3]。上述研究表明，西藏Kefir具有良好的保健和治療慢性腸道疾病和降低膽固醇的作用，但國(guó)內(nèi)外目前只對(duì)其微生物菌群及其發(fā)酵特性研究較多，而對(duì)其抑菌物質(zhì)基礎(chǔ)及其抑菌機(jī)理研究鮮見報(bào)道。本文采用水提取西藏Kefir抑菌成分，以常見的革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌為受試菌進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，初步研究了其提取物的抑菌效果，為進(jìn)一步研究開菲爾中抑菌活性成分的分離純化、抑菌物質(zhì)基礎(chǔ)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

開菲爾粒 采集于西藏；供試菌種：啤酒酵母菌（Sac-charomycescerevisiae）、大腸桿菌（Escherichiacol）i、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae）、霉菌（Aflatoxin），以上菌種均為食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；培養(yǎng)基 牛肉浸膏蛋白胨培養(yǎng)基，察氏培養(yǎng)基；試劑 均為分析純；奶粉 市售，伊利學(xué)生營(yíng)養(yǎng)奶粉。

R201BL型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；FD-1PF型立式冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；TDL-5型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科技儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Kefir發(fā)酵液的制備[9]開菲爾粒用無菌水沖洗后，按2%（W/V）的比例接種到奶粉配制的牛奶（20%）中，30℃培養(yǎng)24h，濾出Kefir粒，得Kefir發(fā)酵液。1.2.2 Kefir中活性成分的提取 將Kefir發(fā)酵液在4000r/min條件下離心30min，取上清液，沉淀用等體積的蒸餾水室溫提取2h，離心，取上清液，合并上清液，在40～50℃濃縮，凍干備用。

1.2.3 K-B紙片法測(cè)定提取物抑菌活性[11]取一定濃度的提取物溶液0.2mL放入20片6mm圓形滅菌濾紙片，充分浸泡后40℃烘干待用。供試菌種采用平板活化，取活化后的菌種用生理鹽水配成1.5×106cfu/mL的菌懸液，并分別取待試菌懸液0.2mL以涂布法制成菌平板，每塊平板內(nèi)等距離放入濾紙片。置于適宜溫度下培養(yǎng)、觀察，并測(cè)定抑菌圈直徑，以生理鹽水作為陰性對(duì)照，濃度為50mg/mL的尼生素溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4 提取物在不同溫度條件下處理及抑菌效果比較 將Kefir提取物用蒸餾水配制成50mg/mL的溶液。分別取1mL置于編號(hào)的實(shí)驗(yàn)瓶，分別置于60、80、100、110℃中處理時(shí)間為10、20min。以未處理為對(duì)照，用K-B紙片法測(cè)試其抑菌效果。

1.2.5 提取物在不同pH條件下處理及抑菌效果比較[12]

將Kefir上清提取物配制成50mg/mL的溶液。用稀鹽酸或氨水調(diào)節(jié)提取物溶液pH分別為2、3、4、5、7、8、9、11，以未處理溶液為對(duì)照，用K-B紙片法測(cè)試其抑菌效果。

1.2.6 提取物在不同光照條件處理及抑菌效果比較[13]將Kefir提取物配制成50mg/mL的溶液，分別放在避光、自然光、日光、紫外光（130W）下處理12h，用K-B紙片法測(cè)試其抑菌效果。

1.2.7 提取物最低抑菌濃度的確定 將提取物配制一定濃度的溶液，采用試管連續(xù)二倍稀釋法[14]分別配成濃度為50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78mg/mL，然后每管加入0.1mL濃度為1.5×106cfu/mL的菌懸液，置恒溫培養(yǎng)。結(jié)果判定:肉湯清亮透明表示無細(xì)菌生長(zhǎng)（-），肉湯渾濁表示有細(xì)菌生長(zhǎng)（+），以能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的Kefir提取物最高稀釋度作為其最低抑菌濃度，以無菌水作對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 Kefir初提物的抑菌活性

經(jīng)過多次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)后表明：Kefir提取物對(duì)痢疾志賀氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和黃曲霉菌均有抑制作用，啤酒酵母菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈達(dá)到11.6mm，尼生素對(duì)黃曲霉和啤酒酵母無抑菌效果，Kefir初提物對(duì)這兩種菌抑菌效果明顯。根據(jù)幾種供試菌的抑菌效果，選取金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌作為后繼活性研究供試菌（見表1）。

表1 兩種不同提取物的抑菌效果（抑菌圈直徑，mm）

2.2 Kefir提取物經(jīng)不同溫度處理后的抑菌效果比較

Kefir提取物經(jīng)60、80、100、110℃等不同溫度處理20min后，對(duì)各種實(shí)驗(yàn)菌的抑菌活性與常溫相比無明顯變化，這說明Kefir初提取物的抑菌活性成分對(duì)熱較穩(wěn)定，在短時(shí)間內(nèi)能耐較高溫度（見表2）。

表2 熱處理Kefir提取物的抑菌活性（抑菌圈直徑，mm）

表3 Kefir提取物經(jīng)不同pH處理后的抑菌效果（抑菌圈直徑，mm）

2.3 Kefir提取物經(jīng)不同pH處理后的抑菌效果比較

Kefir提取物經(jīng)不同pH處理后，pH為1.0～7.0，提取物的抑菌作用隨著pH的提高而降低，在pH為5.0～7.0的抑菌作用大幅度降低：當(dāng)pH在8.0～11.0時(shí)，提取物對(duì)三種指示菌的抑制作用完全消失，由此說明Kefir抑菌活性成分在pH在1.0～7.0較穩(wěn)定，其抑菌效果較好（見表3）。研究結(jié)果表明Kefir提取物中的活性成分在酸性環(huán)境下較穩(wěn)定。

2.4 Kefir提取物經(jīng)不同光照處理后的抑菌效果比較

Kefir提取物經(jīng)日光、太陽(yáng)光和紫外光等光照處理后，其抑菌圈直徑無明顯變化，說明Kefir提取物的抑菌活性成分在24h內(nèi)對(duì)光照較穩(wěn)定，不同光質(zhì)對(duì)Kefir抑菌活性物質(zhì)的影響也較?。ㄒ姳?），說明Kefir提取物在日光、太陽(yáng)光和紫外光處理24h較穩(wěn)定。

表4 提取物受光抑菌實(shí)驗(yàn)

2.5 Kefir提取物最小抑菌濃度的測(cè)定

通過試管連續(xù)二倍稀釋法檢測(cè)上清提取物的最低抑菌濃度，測(cè)定結(jié)果表明：Kefir提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度約為12.5mg/mL，對(duì)痢疾志賀氏菌的最低抑菌濃度為6.25mg/mL，對(duì)啤酒酵母和黃曲霉菌的最低抑菌濃度約為12.5mg/mL（見表5）。結(jié)果表明：Kefir提取物在較低的濃度下對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母和黃曲霉菌均有明顯的抑制效果。

表5 Kefir提取物的最小抑菌濃度（MIC）

3 結(jié)論與討論

通過本文的研究可知：Kefir提取物可以抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，對(duì)部分真菌（酵母和黃曲霉）也有明顯的抑制效果，具有顯著的抑菌效果且抑菌譜較廣泛。提取物抑菌活性成分對(duì)熱（110℃）、不同光質(zhì)和酸較穩(wěn)定。有關(guān)天然食品添加劑的使用，Nisin是最早用于食品，現(xiàn)在被廣泛用于乳制品、肉制品、植物蛋白食品、罐頭食品的防腐保鮮的天然防腐劑[16]。2009年新頒布的GB-2760，天然防腐劑尼生素和納他霉素均在冊(cè)，國(guó)外業(yè)已廣泛應(yīng)用細(xì)菌抑菌蛋白作為安全的食品保藏劑（如防腐或抑菌），但是尼生素只能抑制革蘭氏陰性菌和部分陽(yáng)性菌[17]，納他霉素也只對(duì)真菌有抑制效果，存在抑菌譜窄、價(jià)格昂貴等不足。西藏Kefir作為一種傳統(tǒng)飲料，從中提取獲得的抑菌活性物質(zhì)具有良好的生物安全性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其抑菌活性物質(zhì)具有耐高溫（110℃）及抑菌效果好、抑菌譜廣的特性，因此有必要對(duì)其中的活性成分作進(jìn)一步深入研究，以期研究清楚其抑菌物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Research on the antibacterial activity of substances extracted from Tibet Kefir

HUANG Man-man,CHEN Xue-xiang,XIAO Su-yao,LIN Jian-hui,HUANG Wei-hua,CAO Yong*

（College of Food Science,South China University of Agricultural,Guangzhou 510640,China）

Active constituents in Kefir were extracted by water，the antibiosis activity on Escherichia coli，Staphylococcus aureus Rosen Bach，Bacillus subtilis，Shigella dysenteries，Sac-charomyces cerevisiae and Aflatoxin was studied by K-B slips.The extracts were treated with different pH，temperature，lights，then bacteriostasis was studied.The results showed that extracted antibacterial substance had shown antibiosis on Gram positive bacteria and Gram negative bacteria and parts of epiphyte.The minimum fungicide concentration of extracts was 6.25～12.5mg/mL.Compared with nisin，the antibiosis activity was limited，and more organisms spectrum.Antibacterial substance had good stability to hot，acidity and light.

Tibet Kefir； extract； antibiosis

TS201.1

A

1002-0306（2011）10-0159-03

2010-10-11 *通訊聯(lián)系人

黃曼曼（1986-），女，碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)。