李雪梅，陳 輝，李書(shū)國(guó)，曹雅虹

(河北科技大學(xué)，河北石家莊050018)

馬尾松花粉中總黃酮類(lèi)物質(zhì)提取條件的研究

李雪梅，陳 輝，李書(shū)國(guó)，曹雅虹

(河北科技大學(xué)，河北石家莊050018)

采用溶劑浸提法從馬尾松花粉中提取總黃酮類(lèi)物質(zhì)。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)影響馬尾松花粉黃酮類(lèi)物質(zhì)提取率的因素進(jìn)行了研究，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，脫脂處理對(duì)總黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取率沒(méi)有明顯影響;乙醇是馬尾松花粉總黃酮類(lèi)物質(zhì)的最適提取劑，其最佳提取條件為乙醇濃度95%，料液比為1∶25，溫度為70℃，在此條件下，總黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取率為13.52mg/g。

總黃酮類(lèi)物質(zhì)，馬尾松花粉，提取

松花粉又名松黃，是馬尾松、油松或同屬樹(shù)種的雄性生殖細(xì)胞。由于松花粉源自多年生的木本植物，所以較之草本植物的花粉富集了更多的生命元素和營(yíng)養(yǎng)成分，主要包括蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、糖類(lèi)、有機(jī)酸、核酸、維生素、礦質(zhì)元素、不飽和脂肪酸、黃酮、纖維素、多糖、激素、膽堿、酶和輔酶等，成分種類(lèi)達(dá)200余種，且搭配合理。現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)表明，每100g松花粉中含有1.76g黃酮。黃酮類(lèi)化合物具有降低心肌耗氧量、增加腦血管流量、降血糖、降血脂等作用，同時(shí)它還是一種天然的抗氧化劑，具有清除人體中超氧離子自由基、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的生理活性。因此，在化妝品、保健品以及飼料添加劑等方面都有廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)采用溶劑浸提法提取馬尾松花粉中的總黃酮類(lèi)物質(zhì)，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，從而為松花粉營(yíng)養(yǎng)成分的研究和保健產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供一定的參考［1－3］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

純天然超微破壁馬尾松花粉 北京富元康靈生物科技有限公司，食用型，破壁率≥99%;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 湖南中辰科技有限公司，純度98%;石油醚(沸程:30～60℃)、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 北京北化福瑞化工有限公司，分析純。

VIS－7220型分光光度計(jì) 鄭州創(chuàng)宇科技有限公司;HH－4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市友聯(lián)儀器研究所;TD5A－WS型臺(tái)式低速離心機(jī) 東星(廈門(mén))電子儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品中總黃酮含量的測(cè)定方法 采用“NaNO2－Al(NO3)3－NaOH”方法結(jié)合吸光光度法測(cè)定松花粉中總黃酮的含量［4］。

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10mg，置100mL容量瓶中，加95%乙醇70mL，置于超聲波清洗機(jī)中使之充分溶解，加95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.1mg/mL的蘆丁對(duì)照溶液。

精密吸取蘆丁對(duì)照溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別置于10mL容量瓶中，補(bǔ)充95%的乙醇至5mL，然后加入5%NaNO2溶液0.3mL，使混勻，靜置6min;加入10%Al(NO3)3溶液0.3mL，搖勻，靜置6min;加入4%NaOH溶液4.0mL，再加95%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置12min，以空白樣作參比，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，利用線性回歸，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程(見(jiàn)圖1)。

圖1 蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.1.2 樣品總黃酮的提取與測(cè)定 準(zhǔn)確稱取干燥的破壁松花粉2g，置于100mL帶有膠塞的錐形瓶中，按照一定的料液比加入浸提劑，在一定的溫度條件下提取一定時(shí)間，離心取上清，用95%乙醇定容至100mL，然后按1.2.1.1的操作測(cè)定吸光度值，并代入上述回歸方程，計(jì)算得出樣品的總黃酮含量。

總黃酮提取率(mg/g)=樣品中總黃酮的含量/樣品的質(zhì)量

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以樣品總黃酮提取率為指標(biāo)，對(duì)浸提劑的種類(lèi)、浸提溫度、浸提劑濃度、料液比、浸提時(shí)間等影響總黃酮提取效果的因素進(jìn)行研究，并考察脫脂處理對(duì)總黃酮提取效果的影響。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)松花粉總黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同提取劑對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取效果的影響

在料液比(m/v)1∶20、浸提溫度70℃、浸提時(shí)間2h的條件下，分別采用95%乙醇、乙酸乙酯和蒸餾水提取樣品中的黃酮類(lèi)物質(zhì)，結(jié)果如表2。

表2 不同提取劑對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取效果的影響

從表2可以看出，蒸餾水的提取效果最差，乙醇作為提取劑時(shí)黃酮的提取率最高，這與黃酮在有機(jī)溶劑中有較大的溶解性有關(guān)。資料表明，黃酮類(lèi)化合物的溶解度因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)不同而有很大差異。一般游離苷元難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑及稀堿水溶液中。因此，實(shí)驗(yàn)中采用乙醇作為提取劑。

2.1.2 脫脂處理對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取效果的影響 首先用石油醚對(duì)松花粉進(jìn)行脫脂處理，然后稱取脫脂和不脫脂松花粉各2g，用95%的乙醇，在料液比1∶20，溫度70℃條件下浸提2h，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 脫脂處理對(duì)松花粉總黃酮提取效果的影響

從表3可以看出，松花粉脫脂處理對(duì)黃酮的提取率影響不大，因而從經(jīng)濟(jì)角度和操作方便性角度考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用不脫脂的松花粉為原料。

2.1.3 提取劑濃度對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取效果的影響在料液比1∶20、浸提溫度70℃、浸提時(shí)間2h條件下，用不同濃度的乙醇提取松花粉中的總黃酮類(lèi)物質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 乙醇濃度對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取效果的影響

從表4可以看出，當(dāng)乙醇濃度為90%時(shí)，總黃酮提取率最高，因此后續(xù)單因素實(shí)驗(yàn)中采用90%乙醇作為浸提劑。

2.1.4 料液比對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取效果的影響 采用90%的乙醇作為提取劑，設(shè)定料液比為 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，在溫度 70℃ 條件下浸提 2h，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 料液比對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取效果的影響

從表5可以看出，隨著料液比的不斷減小，總黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取率隨之升高，料液比1∶20時(shí)黃酮的提取率最高，之后，隨著料液比的繼續(xù)減小，總黃酮的提取率沒(méi)有明顯改變，考慮到成本及溶劑回收問(wèn)題，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇1∶20為最適料液比。2.1.5 提取時(shí)間對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取效果的影響 采用90%的乙醇作為提取劑，在料液比1∶20，浸提溫度70℃條件下，分別浸提1、1.5、2、2.5、3、3.5h，結(jié)果如表6 所示。

表6 提取時(shí)間對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取效果的影響

從表6可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮的提取率也隨之增大，浸提2.5h時(shí)達(dá)到最大，而繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，總黃酮提取率又稍有下降，這可能是由于在70℃的條件下長(zhǎng)時(shí)間的加熱會(huì)導(dǎo)致黃酮類(lèi)物質(zhì)中部分熱敏性物質(zhì)的分解或結(jié)構(gòu)的改變，造成吸光度值的減小，因而提取率會(huì)有所下降。因此，選擇2.5h為最佳浸提時(shí)間。

2.1.6 提取溫度對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取效果的影響 采用90%的乙醇作為提取劑，料液比為1∶20，在不同溫度條件下分別浸提時(shí)間2.5h，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 提取溫度對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取效果的影響

從表7可以看出，提取溫度低于70℃時(shí)，隨溫度的升高，黃酮提取率明顯增加，溫度達(dá)70℃時(shí)，黃酮的提取率最高。但超過(guò)70℃，松花粉中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取率反而隨溫度升高而降低。分析其原因，一方面可能是由于溫度過(guò)高，對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)的穩(wěn)定性有一定的影響，同時(shí)溫度過(guò)高時(shí)溶劑揮發(fā)嚴(yán)重，結(jié)果都會(huì)導(dǎo)致總黃酮提取率的降低。因此選擇70℃為最適宜提取溫度。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)2.3中的設(shè)計(jì)方案，采用L9(34)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)馬尾松松花粉中總黃酮的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表8可知，在考察的三個(gè)因素中，影響松花粉中黃酮類(lèi)化合物提取率的主次順序依次為:B＞A＞C，即乙醇濃度＞提取溫度＞料液比，其最佳的提取條件為A2B3C3，即提取溫度70℃、乙醇濃度為95%、料液比1∶25。根據(jù)該條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得馬尾松花粉總黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取率為13.52mg/g。

3 結(jié)論

3.1 松花粉中含有脂肪酸，比較脫脂與不脫脂的松花粉總黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取率，結(jié)果表明提取效果上沒(méi)有明顯的差別，因而松花粉是否經(jīng)過(guò)脫脂處理對(duì)黃酮的提取率影響不大，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，可采用不經(jīng)脫脂處理的松花粉作為原料。

3.2 實(shí)驗(yàn)采用乙醇作為提取劑，松花粉總黃酮類(lèi)物質(zhì)的最佳提取工藝為:乙醇濃度95%、料液比1∶25、提取溫度70℃，在此實(shí)驗(yàn)條件下總黃酮的提取率為13.52mg/g。

［1］毛永強(qiáng).松花粉的營(yíng)養(yǎng)成分及保健功能綜述［J］.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2008(3):50－52.

［2］李娜.松花粉營(yíng)養(yǎng)成分及生物活性的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，14(13):125－127.

［3］王敏.松花粉的成分及藥理作用研究發(fā)展［J］.安徽醫(yī)藥，2008，12(4):357－358.

［4］羅偉強(qiáng)，李濟(jì)權(quán)，黃梅珍.花生殼中總黃酮含量的測(cè)定［J］.西部糧油科技，2002，27(2):48－49.

Extraction of total flavonoids from pinus pollen

LI Xue－mei，CHEN Hui，LI Shu－guo，CAO Ya－h(huán)ong

(Institute of Biological Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China)

The total flavonoids were prepared from pinus pollen by the organic solvents.The factors which influcing the extraction rate of total flavonoids were studied and optimized through single－factor and orthogonal experimental design.The results showed that fat removal treatment had no manifest influence on the extraction of the total flavonoids.The optimal extraction conditions were as follows:95%ethanol concentration，solid to liquid ratio 1∶25，temperature 70℃，time 2.5h.Under this condition，the extraction rate of total flavonoids was 13.52mg/g.

total flavonoids;pinus pollen;extraction

TS201.2

B

1002－0306(2011)08－0264－03

2010－07－29

李雪梅(1971－)，女，在讀博士，副教授，研究方向:食品生物技術(shù)與保健食品。