潘倩茹, 呂芳麗, 宋 寧, 黃世光△

(1暨南大學醫(yī)學院口腔醫(yī)學系, 廣東 廣州 510632；2中山大學醫(yī)學院寄生蟲教研室，廣東 廣州 510080；3深圳市兒童醫(yī)院口腔科，廣東 深圳 518026)

白芍總苷對小鼠實驗性牙周炎血清IgG1和IgG2a水平的影響*

潘倩茹1, 呂芳麗2, 宋 寧3, 黃世光1△

(1暨南大學醫(yī)學院口腔醫(yī)學系, 廣東 廣州 510632；2中山大學醫(yī)學院寄生蟲教研室，廣東 廣州 510080；3深圳市兒童醫(yī)院口腔科，廣東 深圳 518026)

目的觀察白芍總苷(TGP)對小鼠實驗性牙周炎的治療效果，分析TGP對牙周炎的免疫調(diào)節(jié)作用。方法采用清潔級12周齡雄性昆明小鼠60只，隨機分成3組：(l)正常對照組；(2)牙周炎組：用浸有牙周致病菌的5-0絲線結(jié)扎小鼠左側(cè)上頜第1磨牙牙頸部建立牙周炎模型；(3) TGP治療組：同上法復制牙周炎模型，于建模后第5周開始用TGP灌胃。各組動物分別于建模后第4、6、8和10周處死，每組各時點處死動物數(shù)為5只。處死動物前測量牙齦指數(shù)(GI)和牙周附著喪失(AL)；制作頰舌向牙體牙周組織聯(lián)合切片，HE染色，顯微鏡下觀察牙周組織學改變； ELISA法檢測各組小鼠外周血清IgG1和IgG2a水平。結(jié)果(1)GI改變：牙周炎組GI在各個時點均明顯高于正常對照組(P<0.05)，TGP治療組GI水平從第6周起較牙周炎組顯著下降(P<0.05)。(2)AL改變：牙周炎組AL在各個時點明顯高于正常對照組和TGP治療組(P<0.05)，TGP治療組AL在 6、 8和10周時明顯低于牙周炎組(P<0.05)。(3)組織學改變：牙周炎組牙周炎癥破壞明顯；TGP治療組的牙周組織炎癥程度較牙周炎組明顯減輕，且牙周組織出現(xiàn)明顯的修復反應。(4)血清抗體水平：與正常對照組比較，牙周炎組血清IgG1水平明顯下降，IgG2a水平明顯升高(均P<0.05);與牙周炎組比較，TGP治療組血清IgG1水平明顯升高(P<0.05)，IgG2a水平明顯下降(P<0.05)。結(jié)論TGP可能通過降低牙周炎的Th1細胞反應及提高Th2細胞反應，提高小鼠的免疫能力，減輕牙周組織的炎癥程度，對牙周炎發(fā)揮治療作用。

牙周炎; 模型，動物; 抗體; 白芍總苷

牙周疾病是一種以菌斑為始動因子的多因素慢性感染性疾病，是導致成人牙齒喪失的最主要原因。該病是革蘭氏陰性厭養(yǎng)菌如牙齦卟啉單胞菌等對牙周組織所致慢性病理損害的結(jié)果，由細菌激發(fā)的免疫應答和炎癥反應是造成牙周組織破壞的主要原因[1]。牙周炎的發(fā)病過程與Th1、Th2細胞免疫應答平衡的失調(diào)密切相關，表現(xiàn)為Th1細胞功能相對亢進，Th2細胞功能不足；前列腺素(prostaglandins, PGs)、一氧化氮(nitric oxide，NO)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)等炎癥介質(zhì)均參與牙周炎的形成[2]。研究表明白芍總苷(total glucosides of paeony, TGP)具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫和止痛等作用，臨床上廣泛應用于類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的治療，但在牙周炎中的應用尚未見報道。本實驗通過建立小鼠實驗性牙周炎模型，觀察TGP對牙周炎的治療效果，并從細胞免疫學的角度分析其免疫調(diào)節(jié)的作用機制。

材 料 和 方 法

1材料

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級12周齡雄性昆明小鼠購于中山大學醫(yī)學院實驗動物中心；白芍提取物(TGP含量：≥66.7%，HPLC)由香港大學中醫(yī)藥學院陳劍萍助理教授惠贈；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記兔抗鼠IgG1、IgG2a抗體購自北京博蕾德公司。

2方法

2.1動物分組及牙周炎動物模型的建立

① 動物分組 實驗采用清潔級12周齡雄性昆明小鼠60只，體重約37-42 g，于室內(nèi)采光條件良好、清潔、安靜、通風良好、室溫22 ℃左右、光照周期12 h∶12 h、無特殊致病菌的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周后實驗。將實驗小鼠編號，按隨機數(shù)字表法分成3組，每組20只：(1)正常對照組(control group)：正常喂養(yǎng)，牙周不做特殊處理，于第5周開始用蒸餾水(0.2 mL/d)灌胃。 (2)實驗性牙周炎組(experimental periodontitis group)：參照Kimura等[3]的方法，用浸有牙周致病菌的5-0絲線結(jié)扎左側(cè)上頜第1磨牙牙頸部建立實驗性牙周炎模型，并于建模后第5周開始用蒸餾水(0.2 mL/d)灌胃，連續(xù)觀察至第10周。(3)白芍總苷治療組(periodontitis+TGP treatment group)：同上法復制實驗性牙周炎模型，于建模后5周開始用TGP混懸液(0.48 g · kg-1· d-1)灌胃，連續(xù)觀察至第10周。各組小鼠分別于建模后第4、6、8和10周分批處死動物，每組各時點處死動物數(shù)為5只。

② 牙周致病菌絲線的制備 收集臨床確診為慢性牙周炎患者的牙周病變區(qū)域齦下菌斑，置于盛有1.0 mL硫乙醇酸鹽溶液的小瓶中，并充分混勻，以生理鹽水進行10倍系列稀釋，選擇稀釋度為10-3的濃度接種于CDC厭氧血瓊脂平板上，將5-0無菌絲線置于該瓊脂平板上，在厭養(yǎng)菌培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)5 d。

③ 牙周炎動物模型的建立 小鼠用0.7%戊巴比妥鈉[0.1 mL/10 g BW(body weight),ip]麻醉，取仰臥位，固定四肢及頭部，用1%碘酊消毒口腔及口周，用尖探針分離左側(cè)上頜第1磨牙牙齦組織，浸有牙周致病菌的5-0絲線纏繞牙頸部2-3圈，于近中牙齦乳頭處縫扎固定，在前庭溝區(qū)打結(jié)，結(jié)扎線置于齦溝內(nèi)。

④ 牙周致病菌的鑒定 于建模的0 d、7 d用無菌的紙尖收集各組實驗小鼠左側(cè)上頜第一磨牙的齦下菌斑，置于1 mL轉(zhuǎn)送液中，振蕩分散30 s，按10倍系列稀釋法稀釋，取各稀釋度樣本液0.1 mL，分別接種于改良GAM 培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)2-5 d, 對培養(yǎng)的菌落進行分離和生化鑒定。

⑤ 白芍水提取物灌胃 白芍提取物按小鼠體重折算的劑量以蒸餾水配成混懸液 (0.48 g·kg-1·d-1) 灌胃，從結(jié)扎后第5周起開始灌胃給藥，連續(xù)觀察至第10周；正常對照組和實驗性牙周炎組從第5周起每天給予等量的蒸餾水灌胃。

2.2觀察指標及檢測方法

① 牙齦指數(shù)(gingival index，GI)的測量 采用乙醚吸入法麻醉小鼠，取仰臥位，固定四肢及頭部。采用鈍頭牙周探針進行探查，參照L?e法[4]測量牙齦指數(shù)，分為4級: 0表示牙齦健康；1表示牙齦輕度炎癥：牙齦的顏色有輕度改變并輕度水腫，探診不出血；2表示牙齦中等炎癥：牙齦色紅，水腫光亮，探診出血；3表示牙齦嚴重炎癥：牙齦明顯紅腫或有潰瘍，并有自動出血傾向。每顆實驗牙測量近中齦乳頭、正中頰緣、遠中腭乳頭和舌側(cè)齦緣共4個點，記分為4個測量點記分的平均值。

② 牙周附著喪失(attachment loss，AL)的測量 采用乙醚吸入法麻醉小鼠，選用自制牙周探針探測牙周附著喪失數(shù)值，牙周探針的刻度單位與工作端直徑均為0.2 mm。牙周附著喪失為釉牙骨質(zhì)界到牙周袋底的距離，測量部位為實驗牙頰、腭側(cè)近中、中央、遠中共6個點，取平均值。

③ 組織學觀察 采用頸椎脫臼法處死小鼠，取左側(cè)上頜骨標本于10%中性甲醛液中固定48 h以上，修整標本，僅保留磨牙區(qū)段牙齒及牙周組織。采用混合脫鈣液脫鈣，制成頰舌向5μm厚度的牙體牙周組織聯(lián)合切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察結(jié)合上皮、上皮下炎癥細胞浸潤及牙槽骨的吸收情況。

④ 血清標本采集和抗體測定 采用摘眼球法采集血液約1 mL，靜置2 h，4 ℃過夜， 3 000 r/min離心10 min，分離收集上層血清，-20 ℃冰箱內(nèi)冷凍保存。測量血清抗體時，將保存的標本平衡至室溫，放置20 min。ELISA法檢測 IgG1和IgG2a水平：在酶標板的反應孔中加入用0.05 mol/L pH 9.6包被緩沖液稀釋至蛋白質(zhì)含量為1-10 mg/L的抗原 0.1 mL，4 ℃孵育過夜。用含Tween 20的5%PBS洗液洗滌4次。加入稀釋的待測血清，37 ℃放置2 h。分別用PBS與PBST洗滌酶標板2次。加入酶標抗體，37 ℃孵育1 h后洗滌4-6次。加入底物液，37 ℃避光放置30 min。加入2 mol/L H2SO40.05 mL終止反應，混勻后在30 min內(nèi)用酶標儀測量波長為450 nm時各孔的吸光度值(absorbance,A)。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1GI的變化

牙周炎組GI在各個時點均明顯高于正常對照組(P<0.05)；TGP治療組GI水平從第6周起較牙周炎組顯著下降(P<0.05),見表1。

表1 各組小鼠GI的變化

▲P<0.05vscontrol group；*P<0.05vsperiodontitis group.

2AL的變化

牙周炎組AL在各個時點明顯高于正常對照組(P<0.05)；TGP治療組AL在 6、 8和10周時明顯低于牙周炎組(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠AL的變化

▲P<0.05vscontrol group；*P<0.05vsperiodontitis group.

3組織學改變

(1)正常對照組：牙齦上皮結(jié)構(gòu)完整，結(jié)合上皮結(jié)構(gòu)正常、無釘突,牙周膜纖維排列整齊，結(jié)締組織內(nèi)無炎癥細胞浸潤，固有牙槽骨形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，見圖1A、B。(2)實驗性牙周炎組：牙周炎癥破壞明顯，結(jié)合上皮與牙面分離,上皮向根方增殖，組織深部可見大量炎癥細胞浸潤，血管擴張充血，牙周纖維水腫、變性，牙槽骨表面可見活躍的破骨細胞和骨吸收，呈凹坑狀吸收，牙槽嵴頂高度降低，見圖1C、D。(3)TGP治療組：牙周組織炎癥細胞浸潤程度比牙周炎組明顯減輕，結(jié)締組織可見小血管增生，成纖維細胞增生活躍；牙槽骨骨吸收陷窩內(nèi)可見成纖維細胞，少見破骨細胞，見圖1E、F。

4血清抗體水平

由表3可見，牙周炎組各時點IgG1水平均比正常對照組顯著下降(P<0.05)；TGP治療組IgG1水平從第6周起較牙周炎組顯著升高(P<0.05)。

由表4可見，牙周炎組IgG2a水平在各個時點均明顯高于正常對照組(P<0.05)；TGP治療組IgG2a水平從第6周起較牙周炎組顯著下降(P<0.05)。

Figure 1. Histological changes of periodontal tissues(HE staining, ×20). A, B:control group;C,D:periodontitis group;E,F:periodontitis+TGP group.A,C,E:6 weeks;B,D,F:8 weeks.

圖1各組牙周組織HE染色結(jié)果

表3 各組小鼠血清IgG1水平的變化

▲P<0.05vscontrol group；*P<0.05vsperiodontitis group.

表4 各組小鼠血清IgG2a水平的變化

▲P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsperimental periodontitis group.

討 論

關于牙周組織疾病的免疫機制目前尚未清楚[5]。研究表明牙周病的組織損害主要是由宿主對感染的免疫應答和炎癥反應引起，牙周致病菌及其毒性產(chǎn)物通過白細胞介素(interleukin, IL)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、PGs、 NO和MMPs等導致組織炎癥及牙槽骨吸收。近年的研究表明Th1和Th2細胞互為調(diào)節(jié)細胞，通過分泌功能不同的細胞因子相互制約，其平衡維持著機體免疫系統(tǒng)的正常功能[6]。Th1和Th2細胞所致的不同優(yōu)勢免疫應答與疾病的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關[7]。牙周炎時機體的免疫反應向Th1偏移，Th1極化在牙周炎中起著促進炎癥的作用[8]；而Th2型細胞反應可減輕牙周組織的破壞，提示Th2免疫應答對牙周感染具有免疫保護作用[9,10]。

抗體的產(chǎn)生受Th1、Th2細胞因子的調(diào)控，并與特異性抗體IgG亞類的表達水平相關。Th1細胞因子刺激IgG2a的產(chǎn)生，Th2細胞因子促進IgG1的合成。Houri-Haddad等[11]的研究顯示慢性心理應激能顯著升高小鼠血清IgG2a水平，提示心理應激時機體的免疫反應表現(xiàn)為Th1極化，加重牙槽骨吸收。O’Brien-Simpson等[12]用P.gingivalis建立小鼠牙周炎模型，同時將RgpA-Kgp蛋白酶黏連復合體接種于動物，結(jié)果檢測到IgG1水平明顯升高，牙槽骨吸收減少，提示Th2細胞反應對牙周炎具有保護作用。通過比較IgG1、IgG2a水平的變化，可以間接反映Th1和Th2細胞免疫應答的變化[13]。本研究中，實驗性牙周炎組小鼠GI和AL明顯升高，血清IgG1水平明顯低于正常對照組，IgG2a水平明顯高于正常對照組，提示實驗性牙周炎時Th2細胞功能相對不足，Th1功能亢進，使牙周炎癥加重。

白芍(radixPaeoniaealba)別名白芍藥、金芍藥，多年生草本，為毛莨科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)的去皮干燥根。其主要的有效成分為TGP，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)及止痛等作用。TGP能抑制纖維化大鼠肝組織核轉(zhuǎn)錄因子 κB (nuclear transcription factor κB，NF-κB)、TNF-α、NO和轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)的表達，并能抑制高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box 1 pronetein，HMGB1)的核轉(zhuǎn)位和釋放而發(fā)揮抗炎作用[14]。TGP還可以通過降低誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表達而抑制大鼠腹腔巨噬細胞NO合成及TNF-α、IL-1β、IL-2等的過度分泌[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，實驗性牙周炎經(jīng)TGP治療后血清IgG1水平比牙周炎組明顯升高，IgG2a在TGP治療后明顯下降，表明TGP能抑制Th1細胞反應，促進 Th2細胞反應；組織學也觀察到牙周組織出現(xiàn)明顯修復反應，炎癥細胞浸潤減少，成纖維細胞增生活躍，局部有新骨基質(zhì)沉積。總之，TGP通過降低牙周炎Th1細胞反應及提高Th2細胞反應，提高小鼠的免疫能力，減輕牙周組織炎癥程度，對牙周炎發(fā)揮治療作用。這一結(jié)果將為牙周炎的免疫治療提供科學理論依據(jù)。

[1] Deo V, Bhongade ML. Pathogenesis of periodontitis: role of cytokines in host response[J].Dent Today,2010,29(9):60-62，64-66.

[2] Liu YC, Lerner UH, Teng YT. Cytokine responses against periodontal infection: protective and destructive roles [J]. Periodontol 2000，2010，52(1):163-206.

[3] Kimura S, Nagai A, Onitsuka T, et al. Induction of experimental periodontitis in mice withPorphyromonasgingivalis-adhered ligatures [J]. J Periodontol，2000,71(7): 1167-1173.

[4] L?e H. The gingival index, the plaque index and the retention index systems[J].J Periodontol,1967,38(6 Suppl):610-616.

[5] 張增方,黃世光,黃綺凌,等.旋毛蟲感染促進白細胞介素-4表達并抑制小鼠實驗性牙周炎[J].中國病理生理雜志,2010,26(3):573-576.

[6] Gaffen SL, Hajishengallis G. A new inflammatory cytokine on the block: re-thinking periodontal disease and the Th1/Th2 paradigm in the context of Th17 cells and IL-17 [J]. J Dent Res, 2008,87(9): 817-828.

[7] Gemmell E, Yamazaki K, Seymour GJ. The role of T cells in periodontal disease: homeostasis and autoimmunity[J]. Periodontol 2000,2007,43(1):14-40.

[8] 謝 敏, 黃世光, 宋 寧, 等. Th1極化反應與牙周炎病理改變的實驗研究[J]. 實用口腔醫(yī)學雜志,2010,26(4):457-460.

[9] 謝 敏, 黃世光, 黃綺凌, 等. Th2極化對牙周炎保護作用的實驗研究[J]. 實用口腔醫(yī)學雜志,2009,25(6): 787-790.

[10]Taubman MA, Kawai T. Involvement of T-lymphocytes in periodontal disease and in direct and indirect induction of bone resorption[J]. Crit Rev Oral Biol Med,2001,12(2):125-135.

[11]Houri-Haddad Y, Itzchaki O, Ben-Nathan D, et al. The effect of chronic emotional stress on the humoral immune response toPorphyromonasgingivalisin mice [J]. J periodontal Res, 2003,38(2):204-209.

[12]O’Brien-Simpson NM, Pathirana RD, Paolini RA, et al. An immune response directed to proteinase and adhesin functional epitopes protects againstPorphyromonasgingivalis-induced periodontal bone loss[J]. J Immunol, 2005, 175(6):3980-3989.

[13]Day MJ.Immunolobulin G subclass distribution in caine leishmaniosis:A review and analysis of pitfall in interpretation[J].Vet Parasitol,2007,147(1-2):2-8.

[14]路景濤，孫嫵弋，劉 浩，等. 白芍總苷對免疫性肝纖維化大鼠肝組織NF-κB和TGF-β1蛋白表達的影響[J]. 中國藥理學通報,2008,24(5):588-592.

[15]陳 剛, 郭莉霞, 鄧小紅, 等. 白芍總苷對巨噬細胞一氧化氮和誘導型一氧化氮合酶生成的影響及其機制研究[J]. 中國免疫學雜志, 2008,24(4):345-347,351.

EffectoftotalglucosidesofpaeonyonserumlevelsofIgG1andIgG2ainmousemodelofperiodontitis

PAN Qian-ru1, Lü Fang-li2, SONG Ning3, HUANG Shi-guang1

(1FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofParasitology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;3DepartmentofStomatology,ShenzhenChildren'sHospital,Shenzhen518026,China.E-mail:thshg@126.com)

AIM: To investigate the effect of total glucosides of paeony (TGP) on immune regulation in the mouse model of experimental periodontitis.METHODSSixty 12-week-old male Kunming mice were randomly divided into 3 groups. The naive mice were used for control. In experimental periodontitis group, the mice were ligated by 5-0 braided silk inoculated with putative periodontopathic bacteria around the left first maxillary molar. In periodontitis+TGP treatment group, experimental periodontitis were produced by the same way as above, and the mice were gavaged with TGP at the beginning of the fifth week after the ligature. The mice were sacrificed at week 4，6, 8 and 10. The gingival index (GI) and attachment loss (AL) were measured before the mice were executed. The histological changes of periodontal tissues were observed under microscope with hematoxylin and eosin (HE) staining. The serum levels of IgG1and IgG2ain mice were determined by ELISA.RESULTSGI in periodontitis group was significantly higher than that in control group (P<0.05). GI in periodontitis+TGP treatment group was significantly lower than that in periodontitis group since the 6th week after the ligature (P<0.05). AL in periodontitis group was significantly higher than that in control group(P<0.05). AL in periodontitis+TGP treatment group was significantly lower than that in periodontitis group at week 6, 8 and 10 (P<0.05). The destruction of periodontal tissues in periodontitis group was more serious than that in other groups. The serum level of IgG1in periodontitis group was significantly lower than that in the other two groups(bothP<0.05).The serum level of IgG2ain periodontitis group was significantly higher than that in the other two groups (bothP<0.05).CONCLUSIONTGP may play a significant role in periodontitis in mice by decreasing serum level of IgG2aand increasing the serum level of IgG1.

Periodontitis; Models,animal; Antibodies; Total glucosides of paeony

R781.4

A

1000-4718(2011)08-1462-05

2011-03-27

2011-04-25

國家自然科學基金資助項目(No.81071387)；廣東省自然科學基金資助項目(No.10151008901000006)

△通訊作者 Tel: 020-85221165; E-mail: thshg@126.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.08.002