田艷春，王秀艷

（赤峰學(xué)院 生命科學(xué)系，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

煙酸對滑子菇液體菌種菌絲體得率及胞外多糖的影響

田艷春，王秀艷

（赤峰學(xué)院 生命科學(xué)系，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

以不同濃度的煙酸作為刺激因子，對滑子菇液體培養(yǎng)后的菌絲體及胞外多糖得率進行研究，實驗證明在液體培養(yǎng)基中加入不同濃度的煙酸均可刺激滑子菇菌絲體的生長及其他生物量的得率，當加入煙酸濃度為0.8ppm時，胞外多糖的得率、菌絲體的得率都為最佳，這就為滑子菇的工業(yè)化生產(chǎn)提供了較好的理論依據(jù).

滑子菇；煙酸；菌絲體得率；胞外多糖得率

滑子菇隸屬于真菌門、擔(dān)子菌綱、傘菌目、絲膜菌科、鱗傘屬.原產(chǎn)日本，因它的表面附有一層粘液，食用時滑潤可口而得名.滑子菇不僅味道鮮美，富含有益于人體健康的蛋白質(zhì)、氨基酸及糖類、礦物元素、維生素等營養(yǎng)保健物質(zhì)，而且附著在滑菇菌傘表面的粘性物質(zhì)是一種核酸，對保持人體的精力和腦力大有益處，并且還有抑制腫瘤的作用.據(jù)有關(guān)專家試驗，其提取物對小白鼠s～180和艾氏腹水癌抑制率均為70％.

煙酸也稱作維生素B3，或維生素PP，屬于維生素B族.煙酸是人體必需的13種維生素之一，是一種水溶性維生素，屬于維生素B族.煙酸在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為煙酰胺，煙酰胺是輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的組成部分，參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝，組織呼吸的氧化過程和糖類無氧分解的過程；另外煙酸還可以促進胰島素的反應(yīng)，使人遠離糖尿病.缺乏煙酸主要有以下幾種表現(xiàn)：前驅(qū)癥狀，體重減輕，疲勞乏力，記憶力差、失眠等，如不及時治療會出現(xiàn)皮炎、腹瀉和疾呆現(xiàn)象；皮膚癥狀，典型癥狀常風(fēng)在肢體暴路部位，如手背、腕、前臂、面部、頸部、足背、踝部出現(xiàn)對稱性皮炎；消化系統(tǒng)癥狀，初期很少出現(xiàn)，至皮膚和消化系統(tǒng)癥狀明顯時出現(xiàn)，經(jīng)癥患者可有全身乏力、煩躁、抑郁、健忘及失眠等.重癥則有狂躁、幻聽、神志不清、木僵、甚至癡呆.

本實驗研究了不同濃度煙酸對滑子菇液體菌種菌絲體干重、胞外多糖得率的影響，以期為生產(chǎn)合理添加有關(guān)營養(yǎng)成分，保證高產(chǎn)穩(wěn)定提供參考.

1 實驗流程

滑子菇母種擴大培養(yǎng)——→液體培養(yǎng)——→生長因子實驗——→菌絲體得率和胞外多糖測定

2 材料與方法

2.1 滑子菇母種的擴大培養(yǎng)

2.1.1 實驗材料

（1）實驗菌種：

江蘇省天達食用菌研究所提供

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯（去皮）200g、葡萄糖 20g、瓊脂 20g、水1000mL.

2.1.2 實驗方法

2.1.2.1 培養(yǎng)基的制作

將馬鈴薯去皮，挖掉芽眼，稱200g切成薄片，加入1000mL蒸餾水.在電爐上煮沸15min，并不斷攪拌，直至馬鈴薯煮至酥而不爛的程度，用4至6層紗布過濾，將濾液繼續(xù)加熱，同時加入瓊脂20g,葡萄糖20g，煮沸，使藥品全部溶解.

制備好后的PDA培養(yǎng)基趁熱用漏斗分裝于18mm×18mm或20mm×20mm的干燥試管中,裝入量為試管高度的1/5,切勿使培養(yǎng)基黏附于試管口壁,如有黏附則用干凈的紗布擦去.分裝好后要使試管豎直放置，不能傾斜.塞上棉塞，棉塞在管內(nèi)外長度約2：1，其作用是保證透氣性，防止雜菌感染.

2.1.2.2 培養(yǎng)基滅菌

在分裝好的試管棉塞外部包一層牛皮紙或兩層報紙，以免滅菌時水蒸氣浸濕棉塞.將捆扎好的試管培養(yǎng)基放入全自動立體式高壓蒸汽滅菌鍋，1.47×105Pa壓力下滅菌30min.然后在滅菌完畢自然冷卻至60℃左右時制備成斜面，斜面長度為試管長度的3/4為宜，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，隨機抽取2-3支放入30±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，如培養(yǎng)基表面光滑無雜菌污染，可進行下步實驗或備用.

2018年發(fā)展對象住建局辦公室副主任王芳每次驛站活動結(jié)束后，都會寫下心靈感悟。她在紀事本上寫道：“我要珍惜難得機會，在驛站不斷錘煉自己、讓自己慢慢成長?！?/p>

2.1.2.3 滑子菇母種轉(zhuǎn)管擴大培養(yǎng)

轉(zhuǎn)管擴大培養(yǎng)工作在紫外燈殺菌環(huán)境的超凈工作臺中進行.接種前，將斜面培養(yǎng)基，接種工具，滑子菇母種，酒精燈，75％酒精棉等放入超凈工作臺，封閉進行紫外燈照射消毒30min，然后關(guān)閉紫外燈，打開吹風(fēng)，進行擴繁.

首先將洗干凈的雙手伸入超凈工作臺中，用酒精棉球擦拭雙手和菌種試管外壁，點燃酒精燈，灼燒接種鏟.然后，左手拿斜面試管和菌種管，用右手小拇指和手掌夾住試管的棉塞拔出，將灼燒的接種鏟在火焰上方慢慢伸入母種試管中，待溫度不能灼傷菌種時，鏟出綠豆大小的菌種塊接入斜面試管的中央，保持菌絲朝上并輕壓一下，移出接種鏟（接種鏟在伸入和移出試管過程中不能碰觸試管壁），灼燒試管口和棉塞，塞好棉塞.即完成一支試管的接種，重復(fù)上述操作，接完后放入24±1℃恒溫培養(yǎng)箱中生長.菌絲生長7—8d左右基本滿管，挑選生長健壯、潔白、濃密且均勻的二級母種用于液體菌種的生產(chǎn).

2.2 滑子菇液體菌種的培養(yǎng)

2.2.1 液體菌種培養(yǎng)試驗流程圖

初級液體培養(yǎng)基的制備——→菌種塊的接入及靜置培養(yǎng)——→搖床培養(yǎng)——→次級液體培養(yǎng)基的制備——→生長因子的添加——→菌種液的轉(zhuǎn)接——→搖床培養(yǎng)——→菌絲體干重的測定和胞外多糖的測定

2.2.2 實驗材料

液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：玉米粉5％，蔗糖1％，硫酸鎂0.3％，磷酸二氫鉀0.15％，維生素B1微量.

2.2.3 實驗菌種

母種以PDA培養(yǎng)基為承載的滑子菇二級母種.

2.2.4 實驗方法

2.2.4.1 初級液體培養(yǎng)實驗

首先按配方在70℃恒溫水浴鍋里乳化玉米粉，過濾后取其上清液分裝到250ml錐形瓶內(nèi)，每瓶100ml，然后每瓶加入硫酸鎂0.3g、磷酸二氫鉀0.15g、維生素B15mg、蔗糖1g、玻璃珠10粒、最后用8層紗布封口，用報紙包好后與接種鏟、鑷子、小托盤一起放入滅菌鍋內(nèi)滅菌30min.

將滅好菌的培養(yǎng)基連同擴大培養(yǎng)的菌種一同放入超凈工作臺中紫外燈滅菌30min.打開吹風(fēng)無菌操作，向每一錐形瓶中接入一塊1cm2大小的斜面菌種，接完后置于恒溫箱中24±1℃靜置培養(yǎng)36h，待菌絲延伸至液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入恒溫搖床培養(yǎng)，條件為24±1℃，150r/min，搖床培養(yǎng)可以使菌絲體的菌齡一致，菌絲體保持正常的呼吸，均勻的生長.培養(yǎng)6—7d，當多數(shù)瓶內(nèi)產(chǎn)生絨毛狀分枝的菌絲球，培養(yǎng)液澄清并呈金黃色，散發(fā)淡淡菇香時，關(guān)閉搖床.

2.2.4.2 生長因子實驗

次級液體培養(yǎng)基的配方：馬鈴薯20％，蔗糖1％，磷酸二氫鉀0.15％，硫酸鎂0.3％.

次級液體培養(yǎng)基的制備：制備20％馬鈴薯汁（方法同PDA培養(yǎng)基的制備）2800mL，然后加入蔗糖28g，磷酸二氫鉀8.4g，硫酸鎂4.2g，分裝在28個錐形瓶內(nèi)，每瓶均加入120mL.

表1 生長因子的添加

依次編號，分別加入7個不同濃度的煙酸作為刺激因子（每個濃度做4瓶，以保證實驗的準確性），1號作為對照不加煙酸.向每一錐形瓶加入10顆玻璃珠，用八層紗布封口，外部再包扎一層牛皮紙或兩層報紙放入自動高壓蒸汽滅菌鍋1.47×105Pa壓力下滅菌30min.滅菌后，壓強降到0，溫度降到30℃左右取出，打開吹風(fēng)無菌操作，向每個錐形瓶中接入生長良好的液體菌種的培養(yǎng)液10mL（含菌絲球，并盡量使其菌絲球大小和分布較為均勻），以此來保證每個濃度的煙酸所刺激的菌絲處于相同的起點，接完后置于恒溫箱中24±1℃靜置培養(yǎng)36h，轉(zhuǎn)入恒溫搖床培養(yǎng)，條件為24±1℃，150r/min，培養(yǎng)7d，當多數(shù)瓶內(nèi)產(chǎn)生絨毛狀分枝的菌絲球，培養(yǎng)液澄清并呈棕黃色，散發(fā)淡淡菇香時，關(guān)閉搖床.

考察指標：菌絲生長量（干重），胞外多糖含量.

考察因素：不同濃度的煙酸.

考察方法：單因子實驗法

2.3 測定方法

2.3.1 菌絲干重的測定

將搖床培養(yǎng)的接入不同濃度的煙酸的菌絲體在超凈工作臺中過濾.濾液放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，菌絲體放入60℃烘干箱內(nèi)烘干至恒重，以菌絲體干重（mg/mL）計算菌絲體得率，如表2所示.

表2 不同煙酸濃度下菌絲體得率

圖1 不同煙酸濃度下菌絲體得率

2.3.2 胞外多糖的測定（苯酚-硫酸法）

2.3.2.1 苯酚-硫酸法測胞外多糖的原理

苯酚-硫酸試劑可與游離的寡糖或多糖中的己糖醛酸（或甲苯衍生物）起顯色反應(yīng)，呈橙黃色，且顏色穩(wěn)定，在波長490nm處和一定的濃度范圍內(nèi)，其吸光度與多糖濃度呈線性關(guān)系，從而可以利用分光光度計測定樣品吸光度，并利用標準曲線定量測定樣品的多糖含量.

2.3.2.2 標準曲線繪制

準確稱取干燥葡萄糖0.1g，用去離子水準確定容至100mL，得到1mg/mL葡萄糖溶液，搖勻后備用.準確稱取苯酚9g，去離子水準確定容至60mL，即得到15％的苯酚溶液，棕色瓶中避光備用.取10支試管，第一支為空白對照試管，其余編號2-10，按表3方法操作：

按表3方法加入藥品后震蕩，搖勻，于25℃恒溫水浴箱中保溫20min，然后以1號作為空白對照，在490波長處測定吸光度.以葡萄糖濃度x為橫坐標（ug/mL）,吸光度y為縱坐標，繪制標準曲線如圖2.

表3 繪制標準曲線所加藥品列表

圖2 葡萄糖標準曲線

圖2為490nm處測定的葡萄糖標準曲線圖，由圖可知，其吸光度與葡萄糖濃度呈線性關(guān)系，方程表達式為y=0.0071x-0.132，將樣品通過苯酚-硫酸法測出光吸收值，再根據(jù)標準曲線圖求出樣品中糖濃度.

2.3.2.3 樣品多糖含量的測定

將過濾后保存的濾液從冰箱中取出，分別取各溶液0.05mL稀釋500倍，吸取2mL稀釋后的樣品按上述步驟操作，測出其在490nm波長下的吸光值，再通過標準曲線計算出樣品的多糖含量（mg/mL），制作表格4并繪制成圖3.

表4 不同煙酸濃度下滑子菇胞外多糖得率

圖3 不同煙酸濃度下滑子菇胞外多糖得率

3 結(jié)果分析

3.1 培養(yǎng)基滅菌效果的檢測

滅菌后的斜面培養(yǎng)基取任意3—5支放入30±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，無任何生命生長跡象，可以確定所設(shè)置的滅菌條件達到無菌操作要求，培養(yǎng)基無雜菌污染.可用于下一步試驗.

3.2 母種擴大繁殖菌絲體生長現(xiàn)象

接入PDA斜面培養(yǎng)基的滑子菇菌塊48小時開始定植，7天左右菌絲滿管，其日平均生長速度為1.42cm/d，菌絲潔白、濃密、粗壯、氣生菌絲少、有菇香、為優(yōu)良菌種，適合用于液體培養(yǎng).

4 小結(jié)與討論

4.1 在液體培養(yǎng)基中加入不同濃度的煙酸時對滑子菇菌絲體生長均有不同程度的影響.

由圖1可知：當煙酸濃度在0-0.8ppm時，滑子菇菌絲體得率與其成正相關(guān)；當煙酸濃度為0.8ppm菌絲體率得率達到最高峰；當煙酸濃度為0.8-1.2ppm時，菌絲體得率與其成負相關(guān).由此證明0.8ppm時是促進滑子菇菌絲體生長的最適煙酸濃度.

4.2 在液體培養(yǎng)基中加入不同濃度的煙酸時對滑子菇胞外多糖均有不同程度的影響.

由圖3可知：煙酸濃度在0-0.8ppm時，滑子菇胞外多糖得率與其成正相關(guān)；煙酸濃度為0.8ppm時，胞外多糖得率達到最高峰；煙酸濃度在0.8-1.0ppm時，胞外多糖得率隨煙酸濃度的增大而成負相關(guān)，但仍然促進胞外多糖的積累；煙酸濃度為1.2ppm時，抑制胞外多糖的積累.由此證明0.8ppm時是促進滑子菇胞外多糖積累的最適煙酸濃度.

通過本實驗可得出，在液體培養(yǎng)基中加入不同濃度的煙酸可刺激滑子菇菌絲體的生長及其他生物量得率，當加入煙酸濃度為0.8ppm時，胞外多糖得率、菌絲體的得率都為最佳，這就為滑子菇的工業(yè)化生產(chǎn)提供了較好的參考價值.

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S646.1

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1673-260X（2011）12-0180-03