宋暢

（多美滋嬰幼兒食品有限公司質(zhì)量和食品安全部，上海201206）

嬰幼兒配方乳粉中5種核苷酸的HPLC檢測方法

宋暢

（多美滋嬰幼兒食品有限公司質(zhì)量和食品安全部，上海201206）

研究了液相色譜法檢測嬰幼兒配方乳粉中5種核苷酸的液相色譜檢測方法。樣品經(jīng)酸沉淀后調(diào)節(jié)pH值為6.5～7.0，以液相色譜于278 nm,257 nm波長檢測。各核苷酸的定量限：胞苷酸CMP為1.6 mg/100 g,尿苷酸UMP為1.7 mg/100 g,鳥苷酸GMP為1.8 mg/100 g,次黃嘌呤核苷酸IMP為1.0 mg/100 g,腺苷酸AMP為2.0 mg/100 g。其樣品加標(biāo)回收率為85%～110%。

核苷酸；液相色譜；嬰幼兒配方乳粉；

0 引言

核苷酸是乳中非蛋白氨的組織部分，是DNA和RNA的前體物質(zhì)。核苷酸具有提高嬰兒免疫力，促進(jìn)腸道乳酸菌繁殖，參與脂肪代謝，促進(jìn)長鏈不飽和脂肪酸的產(chǎn)生，有助于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等多種生理功能,也為提高嬰兒的免疫能力和記憶能力發(fā)揮作用。

目前國內(nèi)的嬰幼兒配方乳粉中基本都添加了4～5種核苷酸：胞苷酸CMP，腺苷酸AMP，鳥苷酸GMP，尿苷酸UMP，次黃嘌呤核苷酸IMP。

本文研究了采用HPLC-UV方法對嬰幼兒配方乳粉中的以上4種核苷酸進(jìn)行檢測。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器和試劑

Agilent1100高效液相色譜儀，二極管陣列紫外檢測器或雙波長紫外檢測器，自動進(jìn)樣器；恒溫水浴鍋；pH計。

核苷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取約20～40我mg CMP,UMP,AMP,GMP標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，以水稀釋到100 mL。分別取此溶液1,2,3,5 mL以水稀釋到100 mL。

所用試劑為分析純，色譜純；水為去離子水。

1.2 方法

稱取5 g樣品，以30 mL水溶解，加入3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%高氯酸，放置30 min后以水稀釋到50 mL,過濾后取15 mL濾液，以濃度為5 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.5～7.0，然后以水稀釋到25 mL,過0.45 μm濾膜后進(jìn)樣。

1.3 色譜條件

色譜柱:Supelcosil-18-T,25cm×4.6mm,5 μm。

流動相：3.12 g磷酸二氫鉀，加入6 mL濃度為0.4 mol/L的TAH和140 mL甲醇，加入1 500 mL水后調(diào)節(jié)pH值為4.5，以水稀釋到2 L。

檢測波長278 nm，257 nm。進(jìn)樣量為20 μL。

1.4 測定步驟

1.4.1 色譜平衡

由于流動相中添加了離子對試劑，其色譜柱平衡時間需要至少4 h以上。儀器平衡后連續(xù)進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)品，待出峰時間穩(wěn)定后，表示色譜系統(tǒng)已平衡，可以進(jìn)行分析。

樣品分析結(jié)果如圖1圖2所示。

1.4.2 計算

按下式計算各核苷酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即

式中：C為進(jìn)樣溶液中各核苷酸的質(zhì)量濃度(mg/L)；W為稱樣量。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品譜圖

圖2 樣品譜圖

2 結(jié)果和討論

2.1 沉淀劑的選擇

比較了3種不同的蛋白沉淀方法：酸沉淀，有機(jī)試劑乙腈沉淀和采用亞鐵氰化鉀與醋酸鋅鹽析沉淀。發(fā)現(xiàn)乙腈沉淀不能廣泛適用于各種配方乳粉，它市場上某些配方乳粉不能起到很好的沉淀作用。鹽沉淀雖然沉淀效果較好，但它對液相色譜分離有干擾。對酸沉淀，我們選擇了幾種不同的酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%高氯酸廣泛適用于各種配方乳粉的蛋白沉淀。

2.2 流動相pH值的影響

由于核苷酸在酸性調(diào)件下穩(wěn)定，所以選擇偏酸性的流動相。流動相pH值越低，核苷酸出峰時間越快，選用pH值為4.5的流動相可以使5種核苷酸在色譜柱上均得到較好的分離，檢測時間又可以控制在40 min之內(nèi)。

2.3 方法的的精密度

取3種不同核苷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的嬰幼兒配方乳粉各一份，按上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行定量分析，不同時間重復(fù)6次平行試驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計計算。其中次黃嘌呤核苷酸選擇的添加量很低，是因?yàn)閾?dān)心它可能會轉(zhuǎn)化為尿酸從而對健康帶來長期不利影響，所以在嬰幼兒配方粉中添加量一般都不高。其結(jié)果表1所示。

方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差基本小于10%,IMP雖然添加的含量水平較低，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差差也＜15%。

表1 核苷酸精密度（RSD）mg/100 g

2.4 回收率

取無核苷酸奶粉樣品添加3次不同量的5種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品，按上述實(shí)驗(yàn)方法定量分析后檢查其回收率，如表2。

表2 回收率

2.5 定量限

本方法中5種核苷酸的定量限分別為：CMP 1.6 mg/100 g，UMP 1.7 mg/100 g，GMP 1.8 mg/100 g,IMP 1.0 mg/100 g，AMP 2.0 mg/100 g。其樣品加標(biāo)回收率為85%～110%。

2.6 檢出限

本方法中各核苷酸的檢出限分別為：CMP 1.1 mg/kg，UMP 1.6 mg/kg，GMP 1.6 mg/kg，IMP 1.5 mg/kg，AMP 1.3 mg/kg。

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Determination of nucleotide in infant formula

SONG Chang
(Dumex Baby Food Co.Ltd.,QFS,ShangHai 201206，China）

A HPLC method was developed for determination of nucleotide in infant formula.The sample is precipitated by 13%perchloric acid and adjust pH to 6.5～7.0.Nucleotide is detected by HPLC at 278 nm and 257 nm.The LOQ of the nucleotide were:CMP1.6 mg/100 g,UMP 1.7 mg/100 g,GMP1.8 mg/100 g,IMP1.0mg/100 g,AMP2.0 mg/100 g.The average recovery is in the range of 85%～110%.

Nucleotide;HPLC;Infant formula;

TS252.7

A

1001-2230（2011）01-0048-02

2010-07-19

宋暢（1970-），女，碩士研究生，從事檢測方法的開發(fā)研究。