GC-MS法測(cè)定奶與奶制品中雌二酮?dú)埩袅康难芯?/h1>
2011-10-19 03:20:44劉勇軍劉創(chuàng)基姜艷彬吳銀良雷春娟
中國(guó)乳品工業(yè) 2011年1期
劉勇軍，劉創(chuàng)基，姜艷彬，吳銀良，雷春娟
（1.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京100125;2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江寧波315000）
GC-MS法測(cè)定奶與奶制品中雌二酮?dú)埩袅康难芯?/p>
劉勇軍1，劉創(chuàng)基1，姜艷彬1，吳銀良2，雷春娟1
（1.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京100125;2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江寧波315000）
通過(guò)液液萃取和固相萃取提取、凈化奶與奶制品中添加的雌酮，以TMS衍生化試劑BSTFA衍生化，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（選擇離子模式，選擇離子為m/z218、m/z244、m/z257、m/z342）對(duì)衍生物檢測(cè)分析，確定了樣品中雌酮的定性、定量分析方法，該法檢出限為0.2 μg/kg，定量限為0.8μg/kg。衍生物的峰面積與樣品質(zhì)量濃度在0.5～1000 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸系數(shù)為0.999。雌酮不同加入量的添加回收率為70.1%～93.6%,變異系數(shù)為2.0%～3.7%。該方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品進(jìn)行靈敏、準(zhǔn)確的定性定量分析。
固相萃??；氣質(zhì)聯(lián)用；雌酮；選擇離子監(jiān)測(cè)
0 引言
雌酮（Estrone，ESN），又名α-卵泡激素、雌甾酮、雌酚酮和雌激素酮，雌酮是甾類同化激素(anabolic steroids,Ass)中一種重要的雌激素[1]，獸醫(yī)臨床用于同期發(fā)情和家畜促生長(zhǎng)及提高飼料轉(zhuǎn)化率。但長(zhǎng)期攝入雌激素會(huì)導(dǎo)致女性化、性早熟，特別是雌激素類物質(zhì)具有明顯的致癌效應(yīng)[1,2]。
雌酮的分析方法在有GC法[3]、酶聯(lián)免疫法[4]、HPLC法[5,6]、放射免疫法[7]及HPLC-MS/MS法[8-12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[13-16]等檢測(cè)方法，但通過(guò)檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于奶與奶制品中雌激素檢測(cè)的研究報(bào)道還很少，因此作者在前期制定了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)“奶及奶制品中17β－雌二醇、雌三醇、炔雌醇?xì)埩魴z測(cè)-GC/MS法”的基礎(chǔ)上，采用固相萃取技術(shù)，對(duì)奶與奶制品中的雌酮進(jìn)行提取、凈化處理，利用SIM（選擇離子監(jiān)測(cè)模式）-GC-MS定性、定量分析。
1 實(shí)驗(yàn)
1.1 主要儀器和試劑
主要儀器：AgilentGC6890/5973NMS，配有EI源和自動(dòng)進(jìn)樣器；MiniShaker渦旋振蕩器；Supersicol固相萃取儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；高速離心機(jī);E-EVAP氮吹儀；奧立龍868pH計(jì),MILLI-Q超純水器，SartoriusBL310電子天平，固相萃取小柱：C18(500mg,3mL)。
以下所用試劑，除特別注明者外，均為分析純?cè)噭疄榉螱B/T6682規(guī)定的二級(jí)水。
主要試劑：雌酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%Sigma公司）；甲醇；乙酸銨；冰乙酸；乙腈（色譜純）；乙酸乙酯；正己烷；甲苯；N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺BSTFA（美國(guó)Supelco Park公司）。
1.2 色譜條件
色譜柱:DB-1MS毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25 μm），載氣流量：He，1.0 mL/min，溫度梯度：色譜柱起始溫度100℃(保持1 min)，以20℃/min的升溫速率升至200℃（保持3 min），再以20℃/min的升溫速率升至260℃（保持5 min），再以20℃/min的升溫速率升至280℃（保持5 min）；無(wú)分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL，溶劑延遲8 min；EI源，電離電壓70 eV，進(jìn)樣口溫度220℃，離子源溫度200℃，四極桿溫度160℃，選擇離子監(jiān)測(cè)模式（SIM）。
1.3 樣品處理
1.3.1 樣品中雌酮的提取
1.3.1.1 液態(tài)樣品
量取試料10.0 mL于50 mL離心管中，加入乙腈5 mL和乙酸乙酯15 mL，旋渦振蕩3 min，以7 800 r/min離心5 min，收集上清液于另一50 mL離心管中，然后在殘?jiān)兄貜?fù)提取1次，合并上清液，40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用1 mol/L氫氧化鈉溶液6 mL分3次溶解，轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，加正己烷20 mL旋渦振蕩1 min,以7 800 r/min離心3 min，收集下層提取液，提取液中加1 mL濃度為2.0 mol/L乙酸銨溶液，用冰乙酸調(diào)pH值5.0～5.2，備用。
1.3.1.2 固態(tài)樣品
稱?。?±0.05）g樣品于50 mL離心管中，加入乙腈5 mL和乙酸乙酯20 mL，加1 mL去離子水，旋渦振蕩3 min，以7 800 r/min離心5 min，收集上清液于另一50 mL離心管中，然后在殘?jiān)屑右译? mL和乙酸乙酯20 mL重復(fù)提取1次，合并上清液，其他同液態(tài)樣品處理。
1.3.2 固相萃取凈化樣品
將上述溶液轉(zhuǎn)移到已依次用甲醇5 mL、水5 mL活化的C18小柱上，然后分別用水5 mL和5 mL 40%甲醇水（甲醇∶水=4∶6，體積比）淋洗，抽干，再用甲醇5 mL洗脫，收集洗脫液，在40℃水浴中用氮?dú)獯蹈伞?/p>
在樣液過(guò)柱和洗脫過(guò)程中流速控制在1 mL/min左右。
1.3.3 衍生化
將上述凈化、吹干的試樣至于60℃烘箱中干燥15 min，使試管內(nèi)壁不存任何可視水分。取出冷卻，加入100 μL甲苯和100 μL BSTFA試劑，蓋緊塞子，在渦旋振蕩器高速振蕩1 min，置于80℃恒溫加熱器中衍生60 min。衍生后冷卻至室溫，用甲苯定容至0.5 mL，轉(zhuǎn)移至2 mL進(jìn)樣瓶中，供氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀進(jìn)樣。同時(shí)用雌酮標(biāo)準(zhǔn)使用液作系列同步衍生。
1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精密稱取100 mg雌酮對(duì)照品置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，作為雌酮儲(chǔ)備液。精密量取雌酮儲(chǔ)備液1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為雌酮工作液。分別準(zhǔn)確吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用甲醇稀釋、定容，配制成濃度為0.5～1000 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用100 μL的BSTFA衍生化試劑，按上述衍生化步驟衍生和氣質(zhì)分析。
2 結(jié)果與討論
2.1 氣相色譜-質(zhì)譜分析
取濃度為10 mg/L雌酮用BSTFA衍生生成三甲基硅烷衍生物，進(jìn)行GC-MS全掃描（MS為scan模式，碎片離子掃描范圍為50～600）其scan分析模式質(zhì)譜圖如圖1所示。從全掃描質(zhì)譜可知，雌酮在BSTFA衍生化下進(jìn)行GC-MS全掃描分析，能產(chǎn)生m/z192、m/z218、m/z232、m/z244、m/z 257、m/z285、m/z327、m/z342等系列特征碎片離子，根據(jù)質(zhì)譜SIM模式的要求，分析物質(zhì)產(chǎn)生的碎片離子應(yīng)選擇專屬性強(qiáng)、豐度較高、基線本底低、受外源組分干擾少、空白樣品不產(chǎn)生所選擇的特征碎片或產(chǎn)生信號(hào)特別低。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，m/z 327雖然特征性強(qiáng)，豐度也較高，但在空白樣品中也檢測(cè)到存在有較強(qiáng)的m/z 327離子峰，且在添加樣品檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)m/z 327的本底較高，故特征碎片離子m/z327不予選擇，而特征碎片離子m/z192和m/z232由于豐度太低，也不適合作為SIM模式的選擇性特征離子，所以本方法選擇m/z218、m/z244、m/z257和m/z342作為雌酮的選擇監(jiān)測(cè)特征離子。
圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品中雌酮的質(zhì)譜圖
2.2 衍生化條件的選擇
雌酮結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖2）中含有羥基、酮基和芳環(huán)，側(cè)鏈C3、C17為極性基團(tuán)，低揮發(fā)性，因此不適合直接進(jìn)行GC/MS分析。常用的解決辦法就是將其C3羥基和C17酮基衍生化(硅烷化、酰化和烷基化)為醚類。
實(shí)驗(yàn)中選用了七氟丁酸酐(HFBA)、N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)、N,O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺(BSTFA)和MSTFA-TMIS-DTE四種衍生化試劑進(jìn)行比較。結(jié)果表明，MSTFA-TMISDTE較其它衍生三種衍生效果差一些，效率最高的為BSTFA衍生試劑，能得到較強(qiáng)的分子離子峰。所以本方法采用BSTFA作為衍生化試劑。由于衍生化試劑遇水立即分解且衍生物遇水也容易分解，因此在衍生化操作中應(yīng)特別注意避免接觸水。
圖2 雌酮分子結(jié)構(gòu)
2.3 回歸方程、線性范圍及檢出限
配制雌二醇質(zhì)量濃度分別為0.5，5，10，50，100，500，1 000 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進(jìn)行衍生測(cè)定。測(cè)定得出雌二醇濃度與峰面積在0.5～1 000 μg/L范圍839.內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系；以y表示峰面積A，x表示組分質(zhì)量濃度C（μg/L），求得回歸方程為y=3.25×102x+3.27×103，相關(guān)系數(shù)R2=0.999；通過(guò)回收率，當(dāng)樣品中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2 μg/kg雌酮時(shí)，信/噪比（S/N）大于3，當(dāng)樣品中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8 μg/kg雌酮時(shí)，信/噪比（S/N）大于10，所以本方法確定雌酮的檢出限為0.2 μg/kg，定量限為0.8 μg/kg，好于國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)雌酮檢測(cè)(GC/MS法)的靈敏度要求。
2.4 不同標(biāo)準(zhǔn)品加入量的回收率及重復(fù)性
在不同樣品中分別添加1，5和10 μg/L雌酮，按本研究方法進(jìn)行提取、凈化和衍生化，GC-MS分析結(jié)果如表1所示。標(biāo)準(zhǔn)樣品和添加樣品總離子（TIC）色譜圖和選擇監(jiān)測(cè)離子質(zhì)譜圖如圖3～圖5所示。
表1 雌酮在樣品中不同添加濃度的回收率和精密度
圖3 標(biāo)準(zhǔn)品中雌酮的色譜圖
圖4 樣品加標(biāo)色譜圖
由表1可以看出，分析方法重復(fù)性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～3.7%，雌酮不同加入量的加標(biāo)回收率分別為70.1%～93.6%。
2.5 陰性對(duì)照品的檢測(cè)
稱取樣品倆份，按添加樣品相同的步驟提取、凈化、衍生，GC-MS分析，均未檢測(cè)出雌酮，且添加樣品雌酮色譜出峰處未見(jiàn)明顯雜峰，干擾較少?？瞻咨V圖如圖6所示。
圖5 選擇監(jiān)測(cè)離子質(zhì)譜圖
圖6 空白樣品色譜圖
3 結(jié)論
本文所建立的奶與奶制品中雌酮測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，回收率滿意，操作較簡(jiǎn)便，為國(guó)家建立相應(yīng)的檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)提供了科研思路和科學(xué)技術(shù)參考，同時(shí)為打擊不法分子使用雌酮提供了技術(shù)保證。
[1] 李俊鎖，邱月明，王超，等.獸藥殘留分析[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002：584-585.
[2] BRUEGGEMEIER R W.Male Sex Hormones,Analogs,and Antagonists.In:Wolff M E Ed.Burger’s Medical Chemistry and Drug Discovery[M].John Wiley&Sons,Inc,1996：445.
[3] 李亢宗,李兆琳,李俊.氣相色譜法測(cè)定孕婦尿中痕且雌三醇和雌酮[J].色譜，1988，6(5)：305-307.
[4] 陽(yáng)春,胡碧波.污水處理中雌酮的定量分析[J].重慶大學(xué)學(xué)報(bào),2009,32(6):718-720.
[5] 涂曉明,羅仁才,孫醇，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品5種激素[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,1995,7(4):5-8.
[6] 王凌云,李潔珍,黎敏，等.高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中4種雌激素的殘留量[J].化學(xué)分析計(jì)量,2005,14(4):38-40.
[7] FRANK Z.Use of 125I-Histamine-Labeled Steroid Derivatives as Radioligands for Radioimmunoassay of Natu-Ral and Synthetic Steroids[J].J Steroid Biochem,1981,14:53-62.
[8] 邵兵，楊奕，張晶，等.動(dòng)物源食品中激素多殘留檢測(cè)方法液相色譜－質(zhì)譜/質(zhì)譜法,GB/T 21981-2008[S].
[9] ELEANOR D,LAURIANE R,BRUNO L B,et al.Determination of Hormonal Growth Promoters in Bovine Hair:Comparison of Liquid Chromatography-Mass Spectrometry and Gas Chromatography-Mass Spectrometry Methods for Estradiol Benzoate and Nortestosterone Decanoate[J].Analytica Chimica Acta,2009,637:165-172.
[10] GEORGE K,GEORGIOS T,THEMISTOKLIS D.Determina-Tion of Anabolic Steroids in Bovine Urine by Liquid Chrom-Atography-Tandem Mass Spectrometry[J].Jounal of Chroma-Tography B,2009,877:2330-2336.
[11] 陳慧華,應(yīng)永飛,吳平谷，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定動(dòng)物組織中22種同化激素[J].分析化學(xué)，2009（2）：181-186.
[12] XIONG Z L,SUN X H,HUO T G,et al.Development and Validation of UPLC-MS/MS Method for Simultaneous Determination of Gestodene and Ethinyl Estradiol in Rat Plasma[J].BiomedChromatogr，2010，24:160–168.
[13] HU R K,ZHANG L F,YANG Z G.Picogram Determination of Estrogens in Water Using Large Volume Injection Gas Chromatography–Mass Spectrometry[J].Anal Bioanal Chem,2008,390:349-359.
[14] ASIER V,ARESATZ U,IRANTZU M A,et al.Ultrasonic-Assisted Derivatization of Estrogenic Compounds in a Cup Horn Booster and Determination by GC-MS[J].J.Sep.Sci.，2010,33:104-111.
[15] MARIE D,PIERRE L,ANNE T,et al.Simple Methodology Coupling Microwave-Assisted Extraction to SPE/GC/MS for the Analysis of Natural Steroids in Biological tissues:Application to the Monitoring of Endogenous Steroids in Marine Mussels Mytilus sp[J].Analytica Chimica Acta,2010,657:28-35.
[16] 吳平谷,王強(qiáng),應(yīng)永飛，等.核素內(nèi)標(biāo)結(jié)合固相萃取測(cè)定動(dòng)物肌肉組織中16種同化激素殘留[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，42(11)：836-839.
Determination of estrone in milk and milk product with Gas Chromatography-Mass Spectrometry
LIU Yong-jun1,LIU Chuang-ji1,JIANG Yan-bin1,WU Yin-liang2,LEI Chun-juan1
（1.China Animal Disease Center,Beijing 100125，China；2.Ningbo Academy of Agricultural Sciences,Ningbo 315000，China）
The residual veterinary drug of estrone in milk and milk product was extracted and purified by the method of liquid-liquid partition and solid phase extraction.The estrone was separated and validated by gas chromatography spectrometry(selected ion mode,the selected ions m/z 218,m/z 244,m/z 257 and m/z 342)after derivatization of the purified sample with the TMS derivative reagent of BSTFA,and the qualitative and quantitative analysis method was developed.Its LOD and LOQ is 0.2 μg/L and 0.8 μg/kg,respectively.and there was a good linear correlation between the ratio of peak areas and the concentration of estrone in the add range of 0.5～1000 μg/L,the correlative coefficient is 0.999,the recoveries of different concentration of estrone was 70.1%～93.6%.The RSD of the method was between 2.0%and 3.7%.The method is suitable for the qualitative and quantitative analysis of estrone in the milk and milk product.
solid phase extraction;Gas chromatography-Mass Spectrometry;estrone;selected ion monitoring
TS252.7
A
1001-2230（2011）01-0045-03
2010-09-09
劉勇軍（1976-），男，工程師，主要從事藥理毒理與獸藥殘留研究工作。
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固相萃??；氣質(zhì)聯(lián)用；雌酮；選擇離子監(jiān)測(cè)
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雌酮的分析方法在有GC法[3]、酶聯(lián)免疫法[4]、HPLC法[5,6]、放射免疫法[7]及HPLC-MS/MS法[8-12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[13-16]等檢測(cè)方法，但通過(guò)檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于奶與奶制品中雌激素檢測(cè)的研究報(bào)道還很少，因此作者在前期制定了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)“奶及奶制品中17β－雌二醇、雌三醇、炔雌醇?xì)埩魴z測(cè)-GC/MS法”的基礎(chǔ)上，采用固相萃取技術(shù)，對(duì)奶與奶制品中的雌酮進(jìn)行提取、凈化處理，利用SIM（選擇離子監(jiān)測(cè)模式）-GC-MS定性、定量分析。
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主要儀器：AgilentGC6890/5973NMS，配有EI源和自動(dòng)進(jìn)樣器；MiniShaker渦旋振蕩器；Supersicol固相萃取儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；高速離心機(jī);E-EVAP氮吹儀；奧立龍868pH計(jì),MILLI-Q超純水器，SartoriusBL310電子天平，固相萃取小柱：C18(500mg,3mL)。
以下所用試劑，除特別注明者外，均為分析純?cè)噭疄榉螱B/T6682規(guī)定的二級(jí)水。
主要試劑：雌酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%Sigma公司）；甲醇；乙酸銨；冰乙酸；乙腈（色譜純）；乙酸乙酯；正己烷；甲苯；N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺BSTFA（美國(guó)Supelco Park公司）。
1.2 色譜條件
色譜柱:DB-1MS毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25 μm），載氣流量：He，1.0 mL/min，溫度梯度：色譜柱起始溫度100℃(保持1 min)，以20℃/min的升溫速率升至200℃（保持3 min），再以20℃/min的升溫速率升至260℃（保持5 min），再以20℃/min的升溫速率升至280℃（保持5 min）；無(wú)分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL，溶劑延遲8 min；EI源，電離電壓70 eV，進(jìn)樣口溫度220℃，離子源溫度200℃，四極桿溫度160℃，選擇離子監(jiān)測(cè)模式（SIM）。
1.3 樣品處理
1.3.1 樣品中雌酮的提取
1.3.1.1 液態(tài)樣品
量取試料10.0 mL于50 mL離心管中，加入乙腈5 mL和乙酸乙酯15 mL，旋渦振蕩3 min，以7 800 r/min離心5 min，收集上清液于另一50 mL離心管中，然后在殘?jiān)兄貜?fù)提取1次，合并上清液，40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用1 mol/L氫氧化鈉溶液6 mL分3次溶解，轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，加正己烷20 mL旋渦振蕩1 min,以7 800 r/min離心3 min，收集下層提取液，提取液中加1 mL濃度為2.0 mol/L乙酸銨溶液，用冰乙酸調(diào)pH值5.0～5.2，備用。
1.3.1.2 固態(tài)樣品
稱?。?±0.05）g樣品于50 mL離心管中，加入乙腈5 mL和乙酸乙酯20 mL，加1 mL去離子水，旋渦振蕩3 min，以7 800 r/min離心5 min，收集上清液于另一50 mL離心管中，然后在殘?jiān)屑右译? mL和乙酸乙酯20 mL重復(fù)提取1次，合并上清液，其他同液態(tài)樣品處理。
1.3.2 固相萃取凈化樣品
將上述溶液轉(zhuǎn)移到已依次用甲醇5 mL、水5 mL活化的C18小柱上，然后分別用水5 mL和5 mL 40%甲醇水（甲醇∶水=4∶6，體積比）淋洗，抽干，再用甲醇5 mL洗脫，收集洗脫液，在40℃水浴中用氮?dú)獯蹈伞?/p>
在樣液過(guò)柱和洗脫過(guò)程中流速控制在1 mL/min左右。
1.3.3 衍生化
將上述凈化、吹干的試樣至于60℃烘箱中干燥15 min，使試管內(nèi)壁不存任何可視水分。取出冷卻，加入100 μL甲苯和100 μL BSTFA試劑，蓋緊塞子，在渦旋振蕩器高速振蕩1 min，置于80℃恒溫加熱器中衍生60 min。衍生后冷卻至室溫，用甲苯定容至0.5 mL，轉(zhuǎn)移至2 mL進(jìn)樣瓶中，供氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀進(jìn)樣。同時(shí)用雌酮標(biāo)準(zhǔn)使用液作系列同步衍生。
1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精密稱取100 mg雌酮對(duì)照品置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，作為雌酮儲(chǔ)備液。精密量取雌酮儲(chǔ)備液1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為雌酮工作液。分別準(zhǔn)確吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用甲醇稀釋、定容，配制成濃度為0.5～1000 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用100 μL的BSTFA衍生化試劑，按上述衍生化步驟衍生和氣質(zhì)分析。
2 結(jié)果與討論
2.1 氣相色譜-質(zhì)譜分析
取濃度為10 mg/L雌酮用BSTFA衍生生成三甲基硅烷衍生物，進(jìn)行GC-MS全掃描（MS為scan模式，碎片離子掃描范圍為50～600）其scan分析模式質(zhì)譜圖如圖1所示。從全掃描質(zhì)譜可知，雌酮在BSTFA衍生化下進(jìn)行GC-MS全掃描分析，能產(chǎn)生m/z192、m/z218、m/z232、m/z244、m/z 257、m/z285、m/z327、m/z342等系列特征碎片離子，根據(jù)質(zhì)譜SIM模式的要求，分析物質(zhì)產(chǎn)生的碎片離子應(yīng)選擇專屬性強(qiáng)、豐度較高、基線本底低、受外源組分干擾少、空白樣品不產(chǎn)生所選擇的特征碎片或產(chǎn)生信號(hào)特別低。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，m/z 327雖然特征性強(qiáng)，豐度也較高，但在空白樣品中也檢測(cè)到存在有較強(qiáng)的m/z 327離子峰，且在添加樣品檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)m/z 327的本底較高，故特征碎片離子m/z327不予選擇，而特征碎片離子m/z192和m/z232由于豐度太低，也不適合作為SIM模式的選擇性特征離子，所以本方法選擇m/z218、m/z244、m/z257和m/z342作為雌酮的選擇監(jiān)測(cè)特征離子。
圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品中雌酮的質(zhì)譜圖
2.2 衍生化條件的選擇
雌酮結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖2）中含有羥基、酮基和芳環(huán)，側(cè)鏈C3、C17為極性基團(tuán)，低揮發(fā)性，因此不適合直接進(jìn)行GC/MS分析。常用的解決辦法就是將其C3羥基和C17酮基衍生化(硅烷化、酰化和烷基化)為醚類。
實(shí)驗(yàn)中選用了七氟丁酸酐(HFBA)、N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)、N,O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺(BSTFA)和MSTFA-TMIS-DTE四種衍生化試劑進(jìn)行比較。結(jié)果表明，MSTFA-TMISDTE較其它衍生三種衍生效果差一些，效率最高的為BSTFA衍生試劑，能得到較強(qiáng)的分子離子峰。所以本方法采用BSTFA作為衍生化試劑。由于衍生化試劑遇水立即分解且衍生物遇水也容易分解，因此在衍生化操作中應(yīng)特別注意避免接觸水。
圖2 雌酮分子結(jié)構(gòu)
2.3 回歸方程、線性范圍及檢出限
配制雌二醇質(zhì)量濃度分別為0.5，5，10，50，100，500，1 000 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進(jìn)行衍生測(cè)定。測(cè)定得出雌二醇濃度與峰面積在0.5～1 000 μg/L范圍839.內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系；以y表示峰面積A，x表示組分質(zhì)量濃度C（μg/L），求得回歸方程為y=3.25×102x+3.27×103，相關(guān)系數(shù)R2=0.999；通過(guò)回收率，當(dāng)樣品中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2 μg/kg雌酮時(shí)，信/噪比（S/N）大于3，當(dāng)樣品中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8 μg/kg雌酮時(shí)，信/噪比（S/N）大于10，所以本方法確定雌酮的檢出限為0.2 μg/kg，定量限為0.8 μg/kg，好于國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)雌酮檢測(cè)(GC/MS法)的靈敏度要求。
2.4 不同標(biāo)準(zhǔn)品加入量的回收率及重復(fù)性
在不同樣品中分別添加1，5和10 μg/L雌酮，按本研究方法進(jìn)行提取、凈化和衍生化，GC-MS分析結(jié)果如表1所示。標(biāo)準(zhǔn)樣品和添加樣品總離子（TIC）色譜圖和選擇監(jiān)測(cè)離子質(zhì)譜圖如圖3～圖5所示。
表1 雌酮在樣品中不同添加濃度的回收率和精密度
圖3 標(biāo)準(zhǔn)品中雌酮的色譜圖
圖4 樣品加標(biāo)色譜圖
由表1可以看出，分析方法重復(fù)性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～3.7%，雌酮不同加入量的加標(biāo)回收率分別為70.1%～93.6%。
2.5 陰性對(duì)照品的檢測(cè)
稱取樣品倆份，按添加樣品相同的步驟提取、凈化、衍生，GC-MS分析，均未檢測(cè)出雌酮，且添加樣品雌酮色譜出峰處未見(jiàn)明顯雜峰，干擾較少?？瞻咨V圖如圖6所示。
圖5 選擇監(jiān)測(cè)離子質(zhì)譜圖
圖6 空白樣品色譜圖
3 結(jié)論
本文所建立的奶與奶制品中雌酮測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，回收率滿意，操作較簡(jiǎn)便，為國(guó)家建立相應(yīng)的檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)提供了科研思路和科學(xué)技術(shù)參考，同時(shí)為打擊不法分子使用雌酮提供了技術(shù)保證。
[1] 李俊鎖，邱月明，王超，等.獸藥殘留分析[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002：584-585.
[2] BRUEGGEMEIER R W.Male Sex Hormones,Analogs,and Antagonists.In:Wolff M E Ed.Burger’s Medical Chemistry and Drug Discovery[M].John Wiley&Sons,Inc,1996：445.
[3] 李亢宗,李兆琳,李俊.氣相色譜法測(cè)定孕婦尿中痕且雌三醇和雌酮[J].色譜，1988，6(5)：305-307.
[4] 陽(yáng)春,胡碧波.污水處理中雌酮的定量分析[J].重慶大學(xué)學(xué)報(bào),2009,32(6):718-720.
[5] 涂曉明,羅仁才,孫醇，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品5種激素[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,1995,7(4):5-8.
[6] 王凌云,李潔珍,黎敏，等.高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中4種雌激素的殘留量[J].化學(xué)分析計(jì)量,2005,14(4):38-40.
[7] FRANK Z.Use of 125I-Histamine-Labeled Steroid Derivatives as Radioligands for Radioimmunoassay of Natu-Ral and Synthetic Steroids[J].J Steroid Biochem,1981,14:53-62.
[8] 邵兵，楊奕，張晶，等.動(dòng)物源食品中激素多殘留檢測(cè)方法液相色譜－質(zhì)譜/質(zhì)譜法,GB/T 21981-2008[S].
[9] ELEANOR D,LAURIANE R,BRUNO L B,et al.Determination of Hormonal Growth Promoters in Bovine Hair:Comparison of Liquid Chromatography-Mass Spectrometry and Gas Chromatography-Mass Spectrometry Methods for Estradiol Benzoate and Nortestosterone Decanoate[J].Analytica Chimica Acta,2009,637:165-172.
[10] GEORGE K,GEORGIOS T,THEMISTOKLIS D.Determina-Tion of Anabolic Steroids in Bovine Urine by Liquid Chrom-Atography-Tandem Mass Spectrometry[J].Jounal of Chroma-Tography B,2009,877:2330-2336.
[11] 陳慧華,應(yīng)永飛,吳平谷，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定動(dòng)物組織中22種同化激素[J].分析化學(xué)，2009（2）：181-186.
[12] XIONG Z L,SUN X H,HUO T G,et al.Development and Validation of UPLC-MS/MS Method for Simultaneous Determination of Gestodene and Ethinyl Estradiol in Rat Plasma[J].BiomedChromatogr，2010，24:160–168.
[13] HU R K,ZHANG L F,YANG Z G.Picogram Determination of Estrogens in Water Using Large Volume Injection Gas Chromatography–Mass Spectrometry[J].Anal Bioanal Chem,2008,390:349-359.
[14] ASIER V,ARESATZ U,IRANTZU M A,et al.Ultrasonic-Assisted Derivatization of Estrogenic Compounds in a Cup Horn Booster and Determination by GC-MS[J].J.Sep.Sci.，2010,33:104-111.
[15] MARIE D,PIERRE L,ANNE T,et al.Simple Methodology Coupling Microwave-Assisted Extraction to SPE/GC/MS for the Analysis of Natural Steroids in Biological tissues:Application to the Monitoring of Endogenous Steroids in Marine Mussels Mytilus sp[J].Analytica Chimica Acta,2010,657:28-35.
[16] 吳平谷,王強(qiáng),應(yīng)永飛，等.核素內(nèi)標(biāo)結(jié)合固相萃取測(cè)定動(dòng)物肌肉組織中16種同化激素殘留[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，42(11)：836-839.
Determination of estrone in milk and milk product with Gas Chromatography-Mass Spectrometry
LIU Yong-jun1,LIU Chuang-ji1,JIANG Yan-bin1,WU Yin-liang2,LEI Chun-juan1
（1.China Animal Disease Center,Beijing 100125，China；2.Ningbo Academy of Agricultural Sciences,Ningbo 315000，China）
The residual veterinary drug of estrone in milk and milk product was extracted and purified by the method of liquid-liquid partition and solid phase extraction.The estrone was separated and validated by gas chromatography spectrometry(selected ion mode,the selected ions m/z 218,m/z 244,m/z 257 and m/z 342)after derivatization of the purified sample with the TMS derivative reagent of BSTFA,and the qualitative and quantitative analysis method was developed.Its LOD and LOQ is 0.2 μg/L and 0.8 μg/kg,respectively.and there was a good linear correlation between the ratio of peak areas and the concentration of estrone in the add range of 0.5～1000 μg/L,the correlative coefficient is 0.999,the recoveries of different concentration of estrone was 70.1%～93.6%.The RSD of the method was between 2.0%and 3.7%.The method is suitable for the qualitative and quantitative analysis of estrone in the milk and milk product.
solid phase extraction;Gas chromatography-Mass Spectrometry;estrone;selected ion monitoring
TS252.7
A
1001-2230（2011）01-0045-03
2010-09-09
劉勇軍（1976-），男，工程師，主要從事藥理毒理與獸藥殘留研究工作。
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