胡博，梁金鐘

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱150076）

響應(yīng)曲面法優(yōu)化鼠李糖乳桿菌L7-13增菌因子

胡博，梁金鐘

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱150076）

采用響應(yīng)面方法對(duì)鼠李糖乳桿菌L7-13的增菌因子進(jìn)行了優(yōu)化。以MRS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上添加增菌因子；采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，對(duì)幾種乳酸菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子對(duì)鼠李糖乳桿菌L7-13的增菌影響進(jìn)行評(píng)價(jià)；篩選出對(duì)鼠李糖乳桿菌L7-13增菌效果顯著的3種物質(zhì)以其最佳添加量；然后用旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法確定了3種顯著增菌因子的最佳配比。在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，鼠李糖乳桿菌L7-13的菌體濃度達(dá)到8.1×1010mL-1，比優(yōu)化前的活菌數(shù)7.9×108mL-1提高了近百倍。表明此增殖優(yōu)化培養(yǎng)基適于鼠李糖乳桿菌L7-13菌株的生長(zhǎng)繁殖。

鼠李糖乳桿菌；響應(yīng)曲面；增菌因子

0 引言

益生菌鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus GG，簡(jiǎn)稱LGG)從健康人的腸道中分離得到[1-3]，因其具有的益生特性和自身特點(diǎn)而被深入研究和廣泛應(yīng)用[5]。

隨著益生菌研究不斷深入，也出現(xiàn)了一些問題，比如市售的益生菌產(chǎn)品不但所用的菌種不同，而且在活菌含量、產(chǎn)品中的穩(wěn)定性、耐酸性、耐膽汁性及有無腸溶性等方面的差別，也會(huì)明顯影響有效性[6]。

響應(yīng)面法(Response surface methodology,RSM)是一種優(yōu)化過程的綜合技術(shù),它可快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件,該法己經(jīng)廣泛地應(yīng)用于各類培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件的優(yōu)化實(shí)踐中[10，11]。

因此，本實(shí)驗(yàn)基于以上因素，選取鼠李糖乳桿菌L7-13菌株，在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，利用Design Expert軟件(Version 6.0)響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，對(duì)培養(yǎng)基的增菌因子進(jìn)行優(yōu)化，最終達(dá)到增菌的目的。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與設(shè)備

菌種為鼠李糖乳桿菌L7-13(Lactobacillus rhamnosus GG L7-13)株。

牛肉粉，蛋白胨，酵母粉，瓊脂粉，無水乙酸鈉，葡萄糖，磷酸氫二鉀（生化試劑），蜂蜜（市售），豆?jié){，紅棗汁（自制），低聚果糖，乳清粉，酪蛋白水解物（食品添加劑）。

1.2 儀器設(shè)備

721型分光光度計(jì)，LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器，超凈工作臺(tái)，DHG-9203型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，PHS-3C型pH計(jì)，DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 培養(yǎng)基

活化和計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基）：蛋白胨1.00 g，牛肉粉1.00 g，酵母粉0.50 g，葡萄糖2.00 g，吐溫80 1.00 mL，乙酸鈉0.50 g，檸檬酸二銨0.20 g，MgSO4·7H2O 0.058 g，MnSO4·4H2O 0.025 g，K2HPO40.20 g，蒸餾水100 mL，pH值為6.2～6.4，121℃滅菌15 min后備用。

1.4 方法

1.4.1 菌種的活化與傳代培養(yǎng)

將斜面保藏菌種接種于MRS固體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，得到純菌種后，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的接種量傳代培養(yǎng)于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，作為種子液備用[7-9]。

1.4.2 顯著增菌因子的篩選

采用單因素實(shí)驗(yàn)，以MRS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選取添加一定量的豆?jié){、紅棗汁、乳清粉、蜂蜜、酪蛋白水解物、低聚果糖等可能促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)的增菌因子作為考察對(duì)象，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，分別測(cè)其活菌數(shù)，以MRS培養(yǎng)基+0(g)mL/100 mL各生長(zhǎng)因子為空白對(duì)比實(shí)驗(yàn)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，從而篩選出顯著增菌因子。

其中各組分的質(zhì)量濃度分別為：豆?jié){、紅棗汁5.0～15.0 mL/100 mL，乳清粉0.5～4.0 g/100m L，蜂蜜1.0～4.0 g/100 mL，酪蛋白水解物的添加量0.3～4.0 g/100 mL、低聚果糖0.5～3 g/100 mL。

1.4.3 優(yōu)化混合增菌因子的配比

篩選出影響鼠李糖乳桿菌L7-13株的幾種顯著增菌因子后，采用旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)(Central Composite Rotatable Design，CCRD)法，對(duì)其混合增菌因子進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化配比，以獲得該菌體的混合增菌因子的配方。

中心組合設(shè)計(jì)的總實(shí)驗(yàn)總數(shù)為2K+2K+n0，其中K為自變量總數(shù)，n0為中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)數(shù)。自變量Xi按下式進(jìn)行編碼變換：

式中：Xi為自變量Xi的編碼值，X0為自變量Xi在中心點(diǎn)的值，△xi為自變量變化步長(zhǎng)。

用標(biāo)準(zhǔn)多項(xiàng)式回歸方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，便得到一個(gè)二次多項(xiàng)式，該方程為描述響應(yīng)量(應(yīng)變量)和自變量關(guān)系的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?duì)于2因子系統(tǒng)，模型可描述為：

式中：Y為預(yù)測(cè)響應(yīng)值；β0為截距；βi為線性系數(shù)；βij為平方系數(shù)；βij為交互作用系數(shù)。

本階段實(shí)驗(yàn)輔助軟件為Design Expert軟件(Version 6.0)。實(shí)際考察的變量及其實(shí)驗(yàn)水平編碼如表1所示；采用多元回歸技術(shù)，擬合二次多項(xiàng)模型的CCRD設(shè)計(jì)結(jié)果如表2所示。

1.4.4 活菌數(shù)測(cè)定

采用稀釋平板計(jì)數(shù)法，將菌液10倍遞增稀釋到合適濃度后，取3個(gè)適當(dāng)稀釋度，各抽取0.1 mL菌液于滅好菌的培養(yǎng)皿中，倒入融化好的MRS固體培養(yǎng)基，混合均勻，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，待凝固后，放入恒溫箱，37℃培養(yǎng)48 h，計(jì)菌落數(shù)（菌落數(shù)在30～300個(gè)內(nèi)有效）[9]。

活菌數(shù)=稀釋度×平均活菌數(shù)/個(gè)平皿×0.1 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯著增菌因子的篩選及其最佳濃度的確定

MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加一定量的豆?jié){、紅棗汁、乳清粉、蜂蜜、酪蛋白水解物、低聚果糖，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的接種量接入100 mL三角瓶中，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，測(cè)其活菌數(shù)，與不加增菌因子接種在MRS培養(yǎng)基的鼠李糖乳桿菌L7-13進(jìn)行比較，并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)直方圖如圖1-圖6所示。

圖1 紅棗汁的添加量對(duì)L7-13的影響

圖2 豆?jié){的添加量對(duì)L7-13的影響

圖3 酪蛋白水解物添加量對(duì)L7-13的影響

圖4 乳清粉添加量對(duì)L7-13的影響

圖5 低聚果糖添加量對(duì)L7-13的影響

圖6 蜂蜜添加量對(duì)L7-13的影響

進(jìn)行單因素方差分析可知：豆?jié){(P=0.12068)、紅棗汁(P=0.115275)、乳清粉(P=0.000668)、蜂蜜(P=0.123862)、酪蛋白水解物(P=2.64×10-5)、低聚果糖(P=1.59×10-5)所以，乳清粉、酪蛋白水解物和低聚果糖是影響鼠李糖乳桿菌L7-13增殖的顯著增菌因子。因此，選擇乳清粉、酪蛋白水解物和低聚果糖作為L(zhǎng)7-13的顯著生長(zhǎng)因子，進(jìn)一步考察它對(duì)L7-13生長(zhǎng)的影響。其他可信度較小的因素對(duì)L7-13的增殖無明顯影響，在下一步的培養(yǎng)基優(yōu)化中可不考慮。

2.2 響應(yīng)曲面法(RSM)優(yōu)化混合增菌因子的配比

2.2.1 L7-13菌體濃度多元二次模型方程的建立及檢驗(yàn)

從以上單因素實(shí)驗(yàn)可知，乳清粉、酪蛋白水解物和低聚果糖是L7-13的顯著生長(zhǎng)因子。因此以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選擇以上3個(gè)因子為研究對(duì)象，以L7-13菌體濃度即活菌數(shù)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)旋轉(zhuǎn)中心組合實(shí)驗(yàn)如表1。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行了20組實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如表2所示。

表1 旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平及其編碼g/100mL

X1=(x1-2)/0.5；X2=(x2-2)/0.5；X3=(x3-1)/0.5。

通過Design expert軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得L7-13菌體濃度對(duì)乳清粉、酪蛋白水解物和低聚果糖的二次多項(xiàng)式回歸方程為

表2 旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Y=80.66-5.60X1-5.44X2-2.71X3-17.19X12-15.42X22-15.17X32+0.050X1X2-0.30X1X3+0.33X2X3(3)

式中：Y為L(zhǎng)7-13菌體濃度的預(yù)測(cè)值；X1，X2，X3分別為乳清粉、酪蛋白水解物和低聚果糖的編碼值。由以上方程得出的L7-13菌體濃度預(yù)測(cè)值如表2所示。該二次回歸方程及其各項(xiàng)的方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 L7-13菌體濃度二次多項(xiàng)模型及其各項(xiàng)的方差分析

由表3可以看出，該模型極顯著(P＜0.0001)，失擬項(xiàng)在α=0.1水平上不顯著(P=0.0775＞0.05)，而且經(jīng)分析計(jì)算，該模型的確定系數(shù)R2=0.9735，表明模型與實(shí)際情況擬合很好，因此該模型可用于預(yù)測(cè)L7-13的實(shí)際生長(zhǎng)增殖情況。由表3回歸方程各項(xiàng)的方差分析表明，各因素對(duì)L7-13菌體濃度的線性效應(yīng)皆顯著；且各因素對(duì)L7-13菌體濃度的曲面效應(yīng)也顯著；X1X3，X2X3，X1X2的交互影響顯著。

2.2.2 L7-13菌體濃度響應(yīng)面交互作用與優(yōu)化

由方程(3)所作的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖如圖7～圖9所示。各因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響結(jié)果可通過該組圖直觀反映出來。

由圖7可以看出，在本研究水平范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基中乳清粉含量的增大，L7-13的菌體濃度增加，但其濃度超出一定量時(shí)，反而抑制了L7-13的增殖。即當(dāng)乳清粉質(zhì)量濃度處于1.64～2.21 g/100mL范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)途酃琴|(zhì)量濃度在1.79～2.07 g/100mL范圍內(nèi)時(shí)，才可獲得7.85×1010mL-1的較高的菌體濃度。

乳清粉中含有大量的乳糖和乳蛋白素,能夠?yàn)橹参锶闂U菌提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),可刺激乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖。因此,它們是乳酸菌的天然促生長(zhǎng)因子。

圖8顯示了乳清粉與酪蛋白水解物對(duì)L7-13增殖的交互影響效應(yīng)。由圖8可以看出，當(dāng)酪蛋白水解物在0.70～1.19 g/100 mL范圍內(nèi)時(shí)，當(dāng)乳清粉在1.70～2.15 g/100 mL范圍內(nèi)時(shí)，才可獲得7.76×1010mL-1的較高的菌體濃度。

由圖9可見，當(dāng)乳清粉質(zhì)量濃度為2.00 g/100mL，酪蛋白水解物范圍在1.17～0.83 g/100 mL內(nèi)時(shí)，低聚果糖的質(zhì)量濃度只需1.64～2.21 g/100 mL，就能達(dá)到L7-13菌體濃度的較大值7.47×1010mL-1，而繼續(xù)增加酪蛋白水解物和低聚果糖的質(zhì)量濃度對(duì)L7-13增殖均無益。

由此可見，乳酸菌的酶系比較單純，不能合成多種氨基酸、維生素和生長(zhǎng)因子。因此，為使這些菌正常生長(zhǎng)和大量增殖，除供給碳水化合物外，還必須補(bǔ)充其所不能合成的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

通過對(duì)L7-13菌體濃度模型進(jìn)行求導(dǎo)和解逆矩陣，可以得到模型的極值點(diǎn)，乳清粉的添加量為1.92 g/100 mL，低聚果1.91g/100 mL，酪蛋白水解物0.95 g/100 mL，此時(shí)模型預(yù)測(cè)的最大響應(yīng)值為7.8×1010mL-1。為了證實(shí)預(yù)測(cè)結(jié)果，在上述優(yōu)化條件下和原始的菌體生長(zhǎng)條件下分別進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得出實(shí)際菌體濃度為8.1×1010mL-1，可見該模型能較好地預(yù)測(cè)L7-13的菌體生長(zhǎng)情況。

3 結(jié)論

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)從幾種常見乳酸菌促生長(zhǎng)因子中篩選出對(duì)鼠李糖乳桿菌增菌效果顯著的物質(zhì)及其最佳添加量，通過響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化其混合增菌因子的配方：乳清粉的添加量為1.92 g/100 mL，低聚果糖1.91 g/100 mL，酪蛋白水解物0.95 g/100 mL培養(yǎng)28 h后，測(cè)其活菌數(shù)從優(yōu)化前7.9×108mL-1提高到8.1×1010mL-1，提高了近百倍。表明此增殖優(yōu)化培養(yǎng)基適于鼠李糖乳桿菌L7-13菌株的生長(zhǎng)繁殖，為后續(xù)研究以及產(chǎn)業(yè)化提供了依據(jù)。

4 展望

培養(yǎng)基優(yōu)化僅僅是益生菌鼠李糖乳桿菌L7-13株研究的一個(gè)方面，還有許多方面的問題有待我們繼續(xù)研究和探索，比如它的基因測(cè)序、耐受性、培養(yǎng)條件以及微膠囊化方面的問題都需要我們更加深入的探索。我國(guó)對(duì)于鼠李糖乳桿菌的研究和含鼠李糖乳桿菌產(chǎn)品的開發(fā)起步較晚，而且鮮有產(chǎn)品問世，還需廣大從事功能性保健食品開發(fā)和藥品研究的科研工作者共同努力。

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Studies on enriching factor of Lactobacillus rhamnosus L7-13 strain by response surface methodology

HU Bo,LIANG Jin-zhong
(Harbin University of Commerce,Harbin 150076，China)

Response surface methodology was used to optimize the MRS-based enriching factor of Lactobacillus rhamnosus L7-13 strain.According to the determination of viable count,the enriching effects of several additives were evaluated by using the single-factor test.screen out the main affecting factors on the Lactobacillus rhamnosus L7-13 strain.Then the central composite design and response surface analysis were used to determine the optimal levels of the main factors.Cultived in the optimized medium,the cell numerous of Lactobacillus rhamnosus L7-13 Strain increased from 7.9×108cfu/mL to 8.1×1010cfu/mL.Experiments showed that this media and culture conditions were suitable for growth and reproduction of Lactobacillus rhamnosus L7-13 strain.

Lactobacillus rhamnosus;Response surface methodology;Enriching factor

Q936

A

1001-2230（2011）01-0019-04

2010-09-20

胡博（1985-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。通訊作者：梁金鐘