孔保華，王 宇，夏秀芳，劉 騫，李明清

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

加熱溫度對(duì)豬肉肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

孔保華，王 宇，夏秀芳，劉 騫，李明清

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

本實(shí)驗(yàn)研究在不同溫度(50～90℃)條件下加熱對(duì)豬肉肌原纖維蛋白凝膠特性的影響。結(jié)果顯示：溫度為70、80℃制備的凝膠保水性較好；50℃和60℃形成的凝膠顏色較深；70～90℃形成凝膠的白度基本相同，無顯著差異(P＞0.05)；凝膠硬度和咀嚼性隨溫度的升高先升高后降低，在溫度為70～80℃時(shí)達(dá)最大值；濁度隨著溫度的升高而總體呈升高趨勢(shì)，但達(dá)到70℃以上時(shí)，升高趨勢(shì)變緩。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)研究發(fā)現(xiàn)，在45～65kD之間，在溫度升高到70℃以上時(shí)，逐漸出現(xiàn)了明顯的條帶，表明部分蛋白發(fā)生了分解。表明肌原纖維蛋白在70～80℃所制得凝膠產(chǎn)品的功能特性較好。

肌原纖維蛋白；加熱溫度；功能性；凝膠特性

無論是肉類還是谷物類食物，大部分都需要經(jīng)過加熱才能食用，一般經(jīng)過加熱處理的食物更易于被人體消化和吸收。通過加熱，一方面可以改善食品的色、香、味，使其易于消化吸收；另一方面可以抑制或殺滅食品中的微生物，提高食品貨架期[1]，此外加熱對(duì)于肉制品的品質(zhì)影響也非常大。一般來說，加熱會(huì)引發(fā)一系列的物理化學(xué)反應(yīng)，如質(zhì)構(gòu)變化、風(fēng)味形成等，加熱能使肌肉蛋白質(zhì)(主要是肌原纖維)在合適的條件下形成凝膠。同時(shí)也能夠殺死病原微生物保證食品安全[2]。肌肉蛋白質(zhì)的凝膠性能決定著產(chǎn)品的質(zhì)量、口感、乳化性及保水性等。肌肉凝膠的形成是蛋白變性和蛋白相互凝集形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的一個(gè)過程，肌球蛋白對(duì)凝膠的形成有很大的作用，并容易受到溫度、pH值和離子濃度等的影響[3]。肌球蛋白是肌原纖維蛋白中最重要的一種蛋白質(zhì)，通過電鏡研究不同溫度對(duì)肌原纖維蛋白影響后得出，在30℃加熱30min，對(duì)肌球蛋白沒有影響；在35℃加熱30min，大部分肌球蛋白仍保持完整的結(jié)構(gòu)，有自己單獨(dú)的頭部，僅有少數(shù)肌球蛋白通過頭部結(jié)合形成二聚體；在40℃加熱30min后，肌球蛋白分子大部分形成二聚體，單體很少存在；50℃加熱30min后，肌球蛋白進(jìn)一步凝集，肌球蛋白的尾部很難辨認(rèn)；當(dāng)在60℃加熱30min時(shí)，肌球蛋白凝集成球狀，尾部全部消失[4]。本實(shí)驗(yàn)主要研究在不同溫度(50～90℃)條件下加熱對(duì)肌原纖維蛋白功能性的影響，包括凝膠保水性、凝膠質(zhì)構(gòu)、顏色，并通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳研究加熱對(duì)蛋白質(zhì)的影響，以期通過研究確定形成最好的凝膠功能特性的溫度，以用于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宰后經(jīng)過解僵成熟24h豬背最長肌 北大荒肉業(yè)；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TA-XT plus型質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro System公司；TU-1800紫外-可見光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；冷凍離心機(jī) 上海分析儀器公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；色差計(jì) 上海申光儀器廠；IKA-T18型勻漿機(jī)德國IKA公司；S-3400N掃描電鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白提取

肌原纖維蛋白提取方法參考Liu等[5]的方法并略作修改，取豬背最長肌，剔除脂肪和結(jié)締組織，切成1cm3小塊，加入4倍體積緩沖液(10mmol/L Na3PO4、0.1mol/L NaCl、2mmol/L MgCl2和 1mmol/L EGTA，pH7.0)，勻漿60s，2000×g冷凍離心15min，取沉淀重復(fù)上面步驟兩次，得到粗提的肌原纖維蛋白。然后取此沉淀加入4倍體積的0.1mol/L NaCl溶液，勻漿60s，2000×g冷凍離心15min，重復(fù)此操作一遍，取沉淀加4倍體積的0.1mol/L NaCl溶液，勻漿60s，4層紗布過濾，取上清液，用0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至6.0，2000×g冷凍離心15min，沉淀即為提純的肌原纖維蛋白，4℃冷藏備用。以上操作均在4℃進(jìn)行。用雙縮脲法以標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白測(cè)定肌原纖維蛋白含量。

1.3.2 制備凝膠

用蒸餾水調(diào)節(jié)肌原纖維蛋白(pH7.0)質(zhì)量濃度為40mg/mL，室溫下保持2h取15mL加入到3cm×5cm玻璃稱量瓶中，蓋上蓋子，從25℃開始水浴加熱，當(dāng)中心溫度達(dá)到目標(biāo)溫度(50、60、70、80、90℃)后，繼續(xù)保持加熱20min，隨后取出放入冰浴中30min，4℃保存過夜。

1.3.3 凝膠保水性測(cè)定

凝膠保水性(water holding capacity，WHC)參考Kocher等[6]的方法并略作修改。將制備的肌原纖維蛋白凝膠取出，測(cè)量前在室溫(22±2)℃放置30min。取5g不同的凝膠樣品加入離心管(直徑30mm)中，3000×g 離心15min，去除離心出的水分，稱量凝膠質(zhì)量。按式(1)計(jì)算凝膠保水性。式中：ma為離心后凝膠質(zhì)量；mp為離心管質(zhì)量；mb為離心前凝膠質(zhì)量。

1.3.4 凝膠質(zhì)構(gòu)的測(cè)定

用TA-XT plus 型質(zhì)構(gòu)分析儀進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析。測(cè)定前將肌原纖維蛋白凝膠在室溫(22±2)℃放置30min，然后將待測(cè)樣品連同稱量瓶置于平臺(tái)上固定好，參數(shù)如下：探頭型號(hào)選擇P/0.5，測(cè)試前速度2mm/s，測(cè)試速度1mm/s，測(cè)試后速度2mm/s，下壓距離為凝膠高度的50%，觸發(fā)力為5g[7]。

1.3.5 凝膠白度測(cè)定

凝膠的白度值用色差計(jì)測(cè)定，計(jì)算公式參考Zhu等[8]方法計(jì)算，其中L*、a*和b*值分別為亮度指數(shù)、色調(diào)和彩度指數(shù)，L*=0為黑色，L*=100為白色，+a*值越大，顏色越接近紅色，－a*值越小越接近綠色；+b*值越大，顏色越接近黃色，－b*值越小越接近藍(lán)色[10]。凝膠白度按式(2)計(jì)算。

1.3.6 肌原纖維蛋白濁度的測(cè)定

肌原纖維蛋白的濁度按Benjakul等[9]的方法進(jìn)行測(cè)定。配制蛋白質(zhì)量濃度為1mg/mL的肌原纖維蛋白溶液，然后吸取5mL放入試管中，將試管分別放在不同溫度的水浴鍋中加熱30min，取出，冷卻，以不加蛋白的溶液為空白，在波長600nm處測(cè)定吸光度。

1.3.7 豬肉肌原纖維蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考LaemmLi等[10]的方法進(jìn)行測(cè)定。分離膠15%，濃縮膠5%。

1.3.8 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定

通過掃描電鏡觀測(cè)肌原纖維蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。參考Pan等[11]方法進(jìn)行樣品制備。然后用E-1010型離子濺射鍍膜儀進(jìn)行離子濺射噴金，將處理好的樣品放入樣品盒中進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)分析

全部實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次進(jìn)行3個(gè)平行，每次重新提取肌原纖維蛋白，采用Statistix 8.0 (Analytical Software Inc., USA)線性模型處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行方差分析(ANOVA)。用Duncan氏比較法進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，ANOVA顯著(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加熱溫度對(duì)肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響

通過雙縮脲法測(cè)得所提取的肌原纖維蛋白蛋白質(zhì)含量為6.25%。不同溫度加熱后制備的凝膠的保水性如圖1所示。保水性的高低可直接影響到肉的風(fēng)味、顏色、質(zhì)地、嫩度、凝結(jié)性等[12]，是肌肉食用品質(zhì)評(píng)定的重要指標(biāo)之一。

圖1 不同加熱溫度對(duì)肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響Fig.1 Effect of heating temperature on WHC of myofibrillar protein gels

由圖1可以看出，凝膠的保水性在70、80℃時(shí)達(dá)到最大值，其原因可能是因?yàn)榧≡w維蛋白在70～80℃之間變性達(dá)到最大，蛋白和蛋白的互作形成良好三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，水分被鎖住，提高了保水性。凝膠的實(shí)質(zhì)是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)，將水、脂肪、糖等物質(zhì)包裹在內(nèi)，形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)溶液與蛋白質(zhì)沉淀的中間狀態(tài)。蛋白質(zhì)濃度、加熱溫度、時(shí)間、pH值以及離子強(qiáng)度和種類等對(duì)凝膠的持水性都有影響。結(jié)果顯示最大的保水性值出現(xiàn)在70℃和80℃，可能是因?yàn)?，?0℃到80℃之間，肌原纖維蛋白變性形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在90℃變性的蛋白經(jīng)受蛋白-蛋白相互作用趨勢(shì)的增加使凝膠的強(qiáng)度增加，但過度加熱引起蛋白質(zhì)的變性收縮，使保水性降低，這可能是因?yàn)榫奂F(xiàn)象使蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)部分的破壞。Benjakul等[9]研究指出，當(dāng)溫度小于55℃時(shí)蛋白質(zhì)重鏈及頭部不能形成凝膠的結(jié)構(gòu)。當(dāng)溫度大于60℃時(shí)頭部促成了凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。

2.2 不同加熱溫度對(duì)肌原纖維蛋白凝膠白度的影響

圖2 不同溫度對(duì)肌原纖維蛋白凝膠白度的影響Fig.2 Effect of heating temperature on whiteness of myofibrillar protein gels

由圖2可以發(fā)現(xiàn)，從50℃到70℃凝膠的白度呈升高趨勢(shì)，且差異顯著(P＜0.05)，從70℃到90℃凝膠白度變化不顯著(P＞0.05)。肉的顏色是影響消費(fèi)者購買力的最重要因素[13]。在肌原纖維蛋白加熱到70℃變性的溫度后，凝膠的顏色有較大的改變，并且在隨后繼續(xù)加熱的情況下，顏色并無太大的改變，說明了白度和蛋白的變性有很大關(guān)系。Hwang等[14]用魚糜研究溫度和蛋白變性的關(guān)系，結(jié)果表明魚糜凝膠的白度變化與蛋白變性程度關(guān)聯(lián)。Akamittath等[15]研究認(rèn)為蛋白變性和脂肪氧化會(huì)引起樣品表面亮度L*值和黃色b*值的增大、紅色a*值的降低，同時(shí)組織間自由水分增多，這些變化是由于蛋白質(zhì)的變性或脂肪氧化增加了自由水的含量。

2.3 不同溫度對(duì)肌原纖維蛋白濁度的影響

圖3 不同溫度對(duì)肌原纖維蛋白濁度的影響Fig.3 Effect of heating temperature on turbidity of myofibrillar protein gels

由圖3可見，隨著溫度的升高，濁度總體呈升高趨勢(shì)，從50℃加熱到60℃的過程中，濁度無顯著變化(P＞0.05)。從60℃到70℃的加熱過程中，濁度顯著升高(P＜0.05)，但是隨著溫度的進(jìn)一步升高，濁度變化不明顯(P＞0.05)。這說明，肌原纖維蛋白在60℃到70℃的范圍內(nèi)發(fā)生變性，蛋白分子交聯(lián)作用加大，導(dǎo)致濁度升高。

2.4 不同溫度對(duì)肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

圖4 不同溫度對(duì)肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of heating temperature on TPA of myofibrillar protein gels

由圖4可見，硬度和咀嚼性隨溫度的升高先升高后降低，在50℃到70℃范圍內(nèi)升高比較緩慢，到80℃達(dá)到最大值，但是隨著溫度的進(jìn)一步升高，硬度和咀嚼性有所下降。膠黏性和黏聚性隨著溫度的升高，一直呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。說明溫度升高，蛋白變性加劇，剛性變大而膠黏性減弱。說明加熱到80℃左右是肉品加工的一個(gè)比較好的溫度范圍。Yasul等[16]通過研究兔肉肌原纖維蛋白在不同溫度下凝膠質(zhì)構(gòu)的變化情況指出，兔肉肌球蛋白在60℃時(shí)凝膠硬度達(dá)到最大值，在60～70℃保持恒定，形成凝膠的最適溫度大約為60～70℃。

2.5 肌原纖維蛋白SDS-PAGE凝膠電泳

圖5 不同加熱溫度制得肌原纖維蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.5 SDS-PAGE pattern of myofibrillar proteins at different heating temperatures

由圖5可以看出，不同溫度對(duì)肌原纖維蛋白的分子變化基本無影響，只是隨著溫度的升高，在45～65kD之間，50℃和60℃溫度范圍內(nèi)，此分子質(zhì)量區(qū)間基本沒有蛋白條帶存在；等溫度升高到70、80℃和90℃時(shí)，逐漸出現(xiàn)了明顯的條帶?？赡苁请S著溫度的升高，蛋白有一定的分解。Hernandez-Herrero等[17]報(bào)道鱈魚在凍藏過程中大分子的蛋白(肌球蛋白的重鏈)電泳條帶沒有發(fā)生明顯的變化，而一些連接蛋白發(fā)生了明顯的降解。有文獻(xiàn)報(bào)道[18]研究了添加谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶后，在不同溫度下加熱對(duì)肌原纖維蛋白的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低于50℃的時(shí)候，添加蛋白酶也不會(huì)使蛋白發(fā)生分解，只有溫度高于50℃時(shí)，分子質(zhì)量約200kD的肌球蛋白重鏈，以及95kD的α-肌動(dòng)蛋白會(huì)發(fā)生降解，甚至一些20～40kD的小分子蛋白條帶也被酶解而消失。

2.6 不同溫度對(duì)肌原纖維蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖6 不同溫度對(duì)肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響(×500)Fig.6 Effects of heating temperature on microstructure of myofibrillar protein gel (×500)

由圖6可以看出，在不同的溫度條件下加熱，肌原纖維蛋白凝膠的結(jié)構(gòu)有很大不同，50℃加熱的樣品比較松軟，圖片顯示其結(jié)構(gòu)松散，纖維之間交聯(lián)不緊密。隨著溫度的逐漸升高，凝膠的結(jié)構(gòu)也越來越緊密，到90℃的時(shí)候，圖片顯示蛋白經(jīng)過充分的變性，形成結(jié)構(gòu)良好的空間結(jié)構(gòu)，緊致而且細(xì)膩。

3 結(jié) 論

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，溫度對(duì)豬肉肌原纖維蛋白凝膠的功能特性有較大影響。溫度為70、80℃時(shí)，凝膠的保水性達(dá)到最大值；50～70℃凝膠的白度隨著溫度的升高，呈現(xiàn)一直升高的趨勢(shì)；凝膠的硬度和咀嚼性隨溫度的升高先升高后降低，膠黏性和黏聚性隨著溫度的升高而一直降低。從掃描電鏡圖片來看，在不同加熱溫度條件下制備凝膠的結(jié)構(gòu)有很大不同，隨著溫度的升高，凝膠結(jié)構(gòu)變得越來越致密，但是質(zhì)地在高溫條件下比較粗糙，保水性也不好。綜合比較，70～80℃是最適合豬肉制品加工的溫度范圍。

[1] 向聰. 肉類保藏技術(shù)(二) 肉制品的加熱處理[J]. 肉類研究, 2008, 22(10): 77-80.

[2] 孔保華. 畜產(chǎn)品加工儲(chǔ)藏新技術(shù)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2007: 73-78.

[3] LANIER T C, CARVAJAL P, YONGSAWATDIGUL J. Surimi and surimi seafood[M]. New York: Marcel Dekker, 2004: 78-96.

[4] SHARP A, OFFER G. The mechanism of formation of gels from myosin molecules[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1992, 58:63-73.

[5] LIU Gang, XIONG Youling. Contribution of lipid and protein oxidation to rheological differences between chicken white and red muscle myofibrillar proteins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996,44(3): 779-784.

[6] KOCHER P N, FOEGEDING E A. Microcentrifuge-based method for measuring water-holding of protein gels[J]. Journal of Food Science,1993, 58(5): 1040-1046.

[7] CHIN K B, GO M Y, XIONG Youling. Konjac flour improved textural and water retention properties of transglutaminase-mediated, heat-induced porcine myofibrillar protein gel: Effect of salt level and transglutaminase incubation[J]. Meat Science, 2009, 81(3): 565-572.

[8] ZHU Kerui, KANU P J, CLAVER I P, et al. A method for evaluating hunter whiteness of mixed powders[J]. Advanced Powder Technology,2009, 20(2): 123-126.

[9] BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, ISHIZAKI S, et al. Differences in gelation characteristics of natural actomyosin from two species of bigeye snapper[J]. Journal of Food Science, 2001, 66(9): 1311-1318.

[10] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4[J]. Nature, 1970, 227(5259): 680-685.

[11] PAN B S, YEH W T. Biochemical and morphological changes in grass shrimp muscle following freezing by air blast and liquid nitrogen methods[J]. Journal of Food Biochemistry, 1993, 17(3): 147-160.

[12] HUFF-LONERGAN E, LONERGAN S M. Mechanisms of water-holding capacity of meat: Mechanisms of water-holding capacity of meat: Therole of postmortem biochemical and structural changes[J]. Meat Science,2005, 71(1): 194-204.

[13] FAUSTMAN C, CASSENS R G. The biological basis for discoloration in fresh meat: a review[J]. Journal of Muscle Foods, 1990, 1(3): 217-243.

[14] HWANG J S, LAI K M, HSU K C. Changes in textural and rheological properties of gels from tilapia muscle proteins induced by high pressure and setting[J]. Food Chemistry, 2007, 104(2): 746-753.

[15] AKAMITTATH J G, BREKKE C J, SCHANUS E G. Lipid oxidation and color stability in restructured meat systems during frozen storage[J].Journal of Food Science, 2006, 55(6): 1513-1517.

[16] YASUI T, ISHIOROSHI M, NAKANO H, et al. Changes in shear modulus, ultrastructure and spin-spin relaxation times of water associated with heat-induced gelation of myosin[J]. Journal of Food Science,1979, 44(4): 1201-1204.

Influence of Heating Temperature on Gel Properties of Porcine Myofibrillar Protein

KONG Bao-hua，WANG Yu，XIA Xiu-fang，LIU Qian，LI Ming-qing
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Gel properties of porcine myofibrillar protein (MP) after heat treatment at varying temperatures (50, 60, 70, 80 ℃and 90 ℃) were investigated. The results showed that gels prepared at 70 or 80 ℃ had a better water holding capacity (WHC)compared with those at other temperatures; gels prepared at 50 or 60 ℃ had a darker color, while those at higher temperatures had similar color (P＞0.05). The hardness and chewiness rose at the beginning of heating and then decreased with increasing temperature; the best functional properties were obtained at a temperature ranging from 70 to 80 ℃. Turbidity first went up with increasing temperature and then changed little when the temperature was above 70 ℃. SDS-PAGE studies indicated that visible 45 － 65 kD bands appeared when the temperature reached 70 ℃ or higher, suggesting the occurrence of partial protein degradation. Thus, MP gels formed at a temperature between 70 ℃and 80 ℃ have better functional properties.

myofibrillar protein；heating；functional properties；gelation

TS251.5

A

1002-6630(2011)05-0050-05

2010-07-08

黑龍江省杰出青年基金項(xiàng)目(JC200702)；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(200903012-02)

孔保華(1963—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工。E-mail：kongbh63@hotmail.com