張 琴，李艷賓，曹亞龍

(1.塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學 塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

棉稈稀酸水解及微生物共發(fā)酵生產(chǎn)單細胞蛋白工藝優(yōu)化研究

張 琴1,2，李艷賓1,2，曹亞龍1

(1.塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學 塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

通過正交試驗確定稀酸水解棉稈的最優(yōu)工藝，以纖維素含量最高，木質(zhì)素含量最少為優(yōu)選標準，得到優(yōu)化工藝條件為：硫酸體積分數(shù)1.0%、固液比1:15，于100℃條件下水解2.0h，以此發(fā)酵工藝獲得稀酸水解棉桿用于后續(xù)發(fā)酵工藝研究中。采用Plackett-Burman設計法，從酵母菌接種量、酵母菌接種時間、青霉接種量、共發(fā)酵時間、起始pH值、含水量、溫度、麩皮含量和裝料量9個因素中篩選出裝料量、麩皮含量、共發(fā)酵時間、青霉接種量4個主要影響因素，并通過響應面分析法對工藝條件進行優(yōu)化，獲得的最優(yōu)工藝條件為：青霉接種量10%、麩皮含量4%、裝料量為發(fā)酵罐頭瓶體積(250mL)的1/3、共發(fā)酵時間53h，在此基礎上進行驗證實驗，得到單細胞蛋白含量的平均值為25.38%，與模型的理論預測值(22.79%)僅相差2.59%，說明建立的模型是切實可行的。

棉稈；稀酸水解；微生物；共發(fā)酵；單細胞蛋白

棉花秸稈是新疆廣泛存在的生物質(zhì)資源，在新疆，每年大約有600～750萬t棉稈產(chǎn)生[1-2]。棉花秸稈中木質(zhì)纖維素含量較高，粗蛋白含量約6.5%[3-4]，魏敏等[4-5]對棉稈的飼用價值進行了評價，并研究了其作為綿羊粗飼料的消化情況，認為棉稈是一類有一定粗蛋白含量但干物質(zhì)有效降解率和代謝能都較低的粗飼料且纖維素消化率極低，這可能和棉稈木質(zhì)素含量高有關。為此，如何提高棉稈中的粗蛋白含量，提高纖維素消化率已成為棉稈飼喂中亟待解決的問題。

蛋白質(zhì)含量是衡量動物粗飼料品質(zhì)的主要指標之一[6]。近年來，利用有益微生物發(fā)酵分解秸稈中的纖維素生產(chǎn)單細胞蛋白(single cell protein，SCP)已成為飼料工業(yè)中的研究熱點之一[7]。SCP主要來自微生物包括霉菌、酵母菌和細菌等的培養(yǎng)[7]，秸稈纖維素SCP的生產(chǎn)與纖維素原料的選擇、微生物菌種的發(fā)酵密切相關。秸稈中除含一定量的粗蛋白外，主要還存在木質(zhì)纖維素成分，為此在相關研究中多采用雙菌種混合發(fā)酵，即通過對纖維素和半纖維素降解能力較強的霉菌和酵母菌共發(fā)酵生產(chǎn)單細胞蛋白[8-9]。Xiao等[10]利用不同微生物固態(tài)發(fā)酵水生大型植物生產(chǎn)粗蛋白，結果表明通過黑曲霉和熱帶假絲酵母共發(fā)酵獲得的粗蛋白含量最高。本研究基于棉稈的木質(zhì)纖維素和粗蛋白組成特性，首先通過稀酸水解獲得纖維素含量較高的酸解棉稈，再采用Plackett-Burman設計法和響應面法，對影響酸解棉稈微生物共發(fā)酵生產(chǎn)單細胞蛋白的發(fā)酵條件進行考察和評價，對影響發(fā)酵的重要因素及其交互作用進行研究和探討，建立適宜于酸解棉稈微生物共發(fā)酵的數(shù)學模型，獲得較高的單細胞蛋白產(chǎn)量，從而為棉稈的高效利用和單細胞蛋白的生產(chǎn)提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棉稈采自新疆阿拉爾棉田，風干、粉碎，過20目篩，備用。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

熱帶假絲酵母(Candida tropicalis CICC 1779)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。青霉菌Q59：為本研究室分離保存的能水解糖化棉稈的菌種。

酵母菌活化培養(yǎng)基：麥芽粉5g，pH值自然。酵母菌種子培養(yǎng)基：麥芽粉5g、(NH4)2SO42g、KH2PO41g、MgSO40.5g、pH6.0。青霉種曲：麩皮，添加營養(yǎng)液(營養(yǎng)液的組分及配比：KH2PO40.2g/100mL、(NH4)2SO43g/100mL、MgSO40.05g/100mL)，pH6.0，調(diào)節(jié)含水量為70%。共發(fā)酵培養(yǎng)基：酸解棉稈≤85%，麩皮(按設計量添加)、添加營養(yǎng)液(營養(yǎng)液的組分及配比：KH2PO40.2g/100mL、(NH4)2SO43g/100mL、MgSO40.05g/100mL)，起始pH值和含水量按試驗設計調(diào)節(jié)。

1.3 儀器與設備

ZN-200A微型高速粉碎機 中南制藥機械廠；AR1140精密電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；LDZX-50KB立式電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2F超凈工作臺、HPX-9272MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱、GZX-9140MBE數(shù)顯鼓風干燥箱、HHS-21-4電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；UV754N紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.4 測定方法

1.4.1 纖維素和木質(zhì)素含量測定

采用van Soest等[11]的方法進行測定。

1.4.2 蛋白質(zhì)含量測定

采用半微量凱氏定氮法[12]進行檢測。

1.5 試驗設計方法

1.5.1 棉稈稀酸水解正交試驗設計

結合前人[13-14]關于棉稈和玉米秸稈稀酸水解的研究結果，選取硫酸體積分數(shù)、水解時間、水解溫度和固液比4個主要因素，進行正交試驗，考察其對纖維素和木質(zhì)素含量的影響，正交表選用L16(45)，因素與水平設置見表1。

表1 正交試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.5.2 Plackett-Burman(P-B)設計

Plackett-Burman(P-B)設計法是一種近飽和的兩水平試驗設計方法，能快速有效地從眾多考察因素中篩選出最重要的幾個因素[15]。根據(jù)有關參考文獻[16]的結果，應用Plackett-Burman(P-B)試驗設計法篩選重要影響因素。Plackett-Burman(P-B)試驗因素及水平見表2。

表2 Plackett-Burman設計試驗因素與水平表Table 2 Factors and levels in Plackett-Burman design

1.5.3 Box-Behnken設計及響應面分析

根據(jù)Plackett-Burman(P-B)試驗設計法所篩選出的4個重要因素，利用SAS V8.0統(tǒng)計分析軟件進行試驗Box-Behnken設計，并進行響應面分析，從而確定4個因素的最佳水平。

2 結果與分析

2.1 正交試驗確定棉稈稀酸水解最優(yōu)工藝

表3 稀酸水解L16(45)正交試驗結果Table 3 Orthogonal array design layout and experimental results

棉稈稀酸水解正交試驗結果見表3，根據(jù)極差R的大小判斷，各因素對纖維素含量影響的主次順序為：A＞C＞B＞D，即硫酸體積分數(shù)＞水解溫度＞水解時間＞固液比；對木質(zhì)素含量影響的順序依次為：D＞A＞C＞B，即固液比＞硫酸體積分數(shù)＞水解溫度＞水解時間。

作為一種木質(zhì)纖維素，棉稈的稀酸水解會引起木質(zhì)纖維素成分含量的變化，為利于后續(xù)發(fā)酵的進行，水解工藝以纖維素含量最高、木質(zhì)素含量最少為優(yōu)選標準。從表3可以看出，A因素選取水平2，B因素選取水平4，酸解棉稈纖維素含量最高、木質(zhì)素含量最低；C因素選取水平4和1，纖維素含量高且兩水平間無顯著差異，考慮木質(zhì)素含量于水平1顯著較低，故C因素選取水平1；D因素選取水平3和4，纖維素含量高且各水平間無顯著差異，而木質(zhì)素含量在這兩個水平中以水平3含量最低，故D因素選擇水平3。所以最優(yōu)水平組合可確定為A2B4C1D3，即優(yōu)化工藝參數(shù)為：硫酸體積分數(shù)1.0%、水解時間2.0h、水解溫度100℃、固液比1:15。

表4 正交試驗方差分析表Table 4 Variance analysis for orthogonal array design

從表4可以看出，硫酸體積分數(shù)、水解溫度和水解時間對纖維素含量的影響均達到極顯著水平，固液比對其影響不顯著；硫酸體積分數(shù)、固液比對木質(zhì)素含量的影響極顯著，水解溫度和水解時間對其影響不顯著。

由于表3中沒有A2B4C1D3組合，對其進行了驗證實驗，纖維素含量為44.13%，木質(zhì)素含量為25.48%。經(jīng)比較，最終確定A2B4C1D3為最佳對其稀酸水解工藝組合。

2.2 Plackett-Burman設計篩選重要因素

選用n=12的Plackett-Burman設計，對酵母菌接種量、酵母菌接種時間、青霉接種量、共發(fā)酵時間、起始pH值、含水量、溫度、麩皮含量和裝料量9個因素進行研究，發(fā)酵試驗設計及結果見表5。

采用SASV8.0進行各因素主效應分析結果見表6。從表6可以看出，在9個與發(fā)酵相關的因素中，影響效果為X9＞X8＞X6＞X3＞X4＞X5＞X7＞X2＞X1，最后篩選出裝料量、麩皮含量、共發(fā)酵時間、青霉接種量4個主要影響因素，并且4個因素均達到了95%的顯著水平(P＜0.05)。

表6 Plackett-Burman試驗統(tǒng)計分析結果Table 6 Statistic analysis results of Plackett-Burman design

2.3 響應面分析法確定重要因素的最佳水平

2.3.1 響應面試驗因素水平設計

通過上述Plackett-Burmen設計得到的結果可知，各因素水平可按表6中的效應值選取適當?shù)乃?，并分析出：裝料量、麩皮含量、共發(fā)酵時間、青霉接種量為影響青霉及假絲酵母共發(fā)酵酸解棉稈生產(chǎn)單細胞蛋白結果的4個主要因素，根據(jù)其效應值的大小安排為4個因素3個水平共27個試驗點的響應面分析實驗，因素與水平見表7。

表7 響應面分析試驗因素與水平表Table 7 Factors and levels in response surface design

2.3.2 響應面分析試驗設計及結果

響應面分析通過27次試驗完成，以蛋白質(zhì)含量為響應值，結果見表8。運用SAS軟件對表8結果進行二次回歸分析，得到二次回歸方程為：Y=21.58＋1.39X1＋0.88X2＋2.37X3＋1.28X4＋2.63X1X2－0.22X1X3＋0.66X1X4＋0.88X2X3－0.66X2X4＋0.77X3X4－2.97X12－1.44X22＋0.26X32－1.93X42。對回歸方程求解，當響應值Y有最大值時可求得各因素的編碼值為：X1=0.0741，X2=－0.5820，X3=－3.2965，X4=－0.2115，即最佳發(fā)酵條件為：青霉接種量10%、共發(fā)酵時間53h、麩皮含量4%、裝料量為發(fā)酵罐頭瓶體積(250mL)的 1/3。

表8 Box-Behnken響應面試驗設計及響應值Table 8 Box-Behnken response surface design scheme and experimental results

對回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗，結果見表9、10。從表9可以看出，模型P=0.0030＜0.05，表明回歸模型顯著，復相關系數(shù)R2為86.19%，說明該模型擬合程度良好，誤差小，表明回歸方程可較準確地預測不同條件下單細胞蛋白的含量。

回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結果(表10)顯示，在α=0.01水平上，因素X3對蛋白質(zhì)含量的線性效應顯著，二次項X12對蛋白質(zhì)含量的曲面效應顯著；在α=0.05水平上，因素X1、X4對蛋白質(zhì)含量的線性效應顯著，交互項X1X2、二次項X42對蛋白質(zhì)含量的曲面效應顯著。

表10 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 10 Significance test of each regression coefficient of the established regression equation

圖1為四因素交互作用的曲面圖和等高線圖，曲面圖有極大值，即為穩(wěn)定點。X1和X2交互作用的等高線為橢圓形，說明兩因素間交互作用顯著。其余等高線為近圓形，說明兩因素間交互作用不顯著。

圖1 蛋白質(zhì)含量的響應面及其等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots for the pairwise interactive effects of three variables on protein content

2.3.3 驗證實驗

根據(jù)上述結果進行驗證實驗，3次重復實驗結果表明蛋白質(zhì)平均含量為25.38%，模型的理論預測值為22.79%，二者僅相差2.59%，可見該模型可以較好地反映出青霉及假絲酵母共發(fā)酵酸解棉稈生產(chǎn)單細胞蛋白的工藝條件，說明建立的模型切實可行，具有一定的實踐指導意義。

3 結 論

通過正交試驗獲得了酸解棉稈中纖維素含量較高、木質(zhì)素含量較低的棉稈稀酸水解優(yōu)化工藝條件：硫酸體積分數(shù)1.0%、固液比1:15于100℃條件下水解2.0h，以此發(fā)酵工藝獲得的酸解棉稈纖維素含量高，有利于后續(xù)微生物發(fā)酵的進行。

從酵母菌接種量、酵母菌接種時間、青霉接種量、共發(fā)酵時間、起始pH值、含水量、溫度、麩皮含量和裝料量9個因素中篩選出了裝料量、麩皮含量、共生發(fā)酵時間、青霉接種量4個主要影響因素，其中裝料量、麩皮含量和青霉接種量三因素在后續(xù)的響應面分析試驗中，在α=0.01和α=0.05水平上對蛋白質(zhì)含量的線性效應顯著，說明篩選的因素都是較重要的發(fā)酵影響因子。

響應面法優(yōu)化了酸解棉稈的發(fā)酵條件，獲得的最優(yōu)工藝條件為：青霉接種量為10%、麩皮含量4%、裝料量為發(fā)酵罐頭瓶體積(250mL)的1/3、共發(fā)酵時間53h，在此基礎上進行驗證實驗，得到單細胞蛋白含量的平均值為25.38%，與模型的理論預測值(22.79%)僅相差2.59%，說明建立的模型是切實可行的。

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Acid Hydrolysis of Cotton Stalks and Single Cell Protein Production by Microbial Co-fermentation

ZHANG Qin1,2，LI Yan-bin1,2，CAO Ya-long1
(1. College of Life Sciences, Tarim University, Alaer 843300, China；2. Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin, Tarim University, Alaer 843300, China)

The optimal process for the hydrolysis of cotton stalks with dilute acid was investigated by orthogonal array design on the basis of the highest cellulose content and the lowest lignin content. The optimal acid hydrolysis conditions for cotton stalks was dilute acid concentration of 1.0%, solid-to-liquid ratio of 1:15, hydrolysis temperature of 100 ℃ and hydrolysis time of 2.0 h. Plackett-Burman design was used to screen 4 major factors including material-loading amount in a 250 mL fermentation vessel, bran content, co-fermentation time and Penicillium inoculation amount from 9 factors such as yeast inoculation amount,yeast inoculation time, Penicillium inoculation amount, co-fermentation time, initial pH, water content, temperature, bran content and material-loading amount, and their optimum levels were determined by response surface methodology to be 1/3, 4%, 53 h and 10%, respectively. An average content of single cell protein of 25.38% was obtained in validation experiments developed under the optimal parameters, between which and the theoretical value of 22.79%, there was 2.59% difference. Therefore, this established model is feasible.

cotton stalk；acid hydrolysis；microbes；co-fermentation；single cell protein (SCP)

TQ920.9

A

1002-6630(2011)05-0192-06

2010-06-23

國家自然科學基金項目(30860014)；新疆生產(chǎn)建設兵團高新技術項目(2007GX21)

張琴(1980—)，女，講師，碩士，研究方向為生物質(zhì)資源的微生物轉化。E-mail：jhtabszq@163.com