陳 紅，張 波，劉秀奇，李 紅，王大為*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

超聲波輔助提取水溶性大豆多糖及純化工藝

陳 紅，張 波，劉秀奇，李 紅，王大為*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

以脫脂擠壓豆渣為原料，對超聲波輔助提取水溶性大豆多糖及純化工藝進(jìn)行研究。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定最佳工藝參數(shù)為提取pH4.5、熱水溫度90℃、液料比20:1(mL/g)、超聲波功率200W、超聲波提取時(shí)間40min時(shí)，水溶性大豆多糖的得率為8.82%。純化粗多糖的條件為Sevag試劑中氯仿與正丁醇體積比3:1、萃取3次，所得純化多糖的回收率為60.30%。

脫脂擠壓豆渣；水溶性大豆多糖；超聲提??；純化

我國是世界上加工大豆的主要國家之一，工業(yè)生產(chǎn)中一般會(huì)產(chǎn)生30%～35%的豆渣(soybean residue，SR)，由于其水分含量大，極易腐敗變質(zhì)[1]，通常用作飼料或廢棄，造成浪費(fèi)。豆渣的主要成分是子葉部的細(xì)胞壁多糖，約含30%的水溶性大豆多糖[2-3]。水溶性大豆多糖簡稱大豆多糖，它是一種酸性多糖，主要成分是半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、海藻糖以及木糖等，具有多種生物活性，是一種天然的功能性成分，它可以改善食品的食用品質(zhì)、加工特性，能夠抑制脂類氧化[4]和穩(wěn)定酸性飲料中的蛋白質(zhì)[5]，還可以作為食品中的乳化成分[6]，在食品中具有廣泛的應(yīng)用前景。在抗氧化、抗菌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等方面也有一定功效[7]。大豆多糖傳統(tǒng)的提取方法是熱水浸提，該法得率低、操作費(fèi)時(shí)、能耗大。近年來，超聲波、微波等輔助提取方法已應(yīng)用于多糖的提取[8-15]。兩種方法操作簡單，可大大縮短提取時(shí)間。美國環(huán)保局(EPA)已經(jīng)將超聲波提取法作為基本分析方法[16]。本研究以脫脂擠壓豆渣為原料，將超聲波技術(shù)應(yīng)用于大豆多糖的提取，并對其粗多糖進(jìn)行純化，旨在為工業(yè)化提取大豆多糖提供新方法，以期能提高豆渣的利用率，降低大豆產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

豆渣(烘干，經(jīng)檢測干豆渣含水分8.45%、蛋白質(zhì)18.61%、脂肪11.87%、纖維素52.46%、灰分3.52%)市購。

濃硫酸、苯酚、無水乙醇、9 5%乙醇、氯仿、正丁醇、葡萄糖、丙酮等(均為分析純)；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司。

101型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；VCX500型超聲波破碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；LJX-Ⅱ型離心沉淀機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠；722型可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；6K-80電熱恒溫水浴鍋 常州市國立試驗(yàn)設(shè)備研究所；GB204分析天平 日本島津公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海申勝生物科技有限公司；FD21冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 超聲波輔助提取與純化工藝流程

干豆渣→索氏提取(乙醚脫脂)→擠壓(單螺桿擠壓機(jī))→粉碎(過40目篩)→加一定溫度蒸餾水→調(diào)pH值→超聲波輔助浸提→離心(4500r/min，30min)→取上清液→濃縮→95%乙醇沉淀粗多糖→抽濾→稱量計(jì)算得率→水溶解→Sevag試劑去蛋白→95%乙醇沉淀→離心(4000r/min，20min)→沉淀物→無水乙醇洗滌→真空冷凍干燥→測定多糖含量

1.2.2 樣品中大豆多糖得率計(jì)算

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

大豆多糖測定采用改進(jìn)的苯酚-硫酸法[17]。精確稱取105℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品25mg于250mL容量瓶中加水定容，搖勻，然后分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，各以水補(bǔ)至2.0mL，然后加入6%苯酚液1.0mL，再加濃硫酸至總體積達(dá)10mL，混合均勻后，室溫放置30min，在波長490nm處測定吸光度，以2.0mL水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為葡萄糖質(zhì)量濃度、縱坐標(biāo)為吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程為：

A=0.0129C＋0.029，r=0.997

式中：A為吸光度；C為測定液質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

1.2.2.2 大豆多糖得率計(jì)算

吸取樣品液1.0mL按上述步驟操作，在波長490nm處測定大豆多糖吸光度。重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出樣品液中大豆多糖的含量，并計(jì)算多糖得率。

1.2.3 多糖提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用單因素試驗(yàn)分別考察pH值、液料比、熱水溫度、超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度6個(gè)因素對大豆多糖得率的影響程度，選擇最佳的提取工藝條件。

1.2.4 多糖提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了優(yōu)化提取工藝條件，參照單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9(34)，其因素及水平見表1。

表1 多糖提取正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels in orthogonal tests

1.2.5 多糖純化

應(yīng)用Sevag法[18-20]去除大豆多糖中的蛋白質(zhì)。此方法條件溫和，可避免多糖降解。用于除蛋白的Sevag試劑(氯仿＋正丁醇)具有不同比例，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合大豆多糖的性質(zhì)，選擇Sevag試劑的最佳比例及萃取次數(shù)，以取得最高的純化多糖的回收率。

本實(shí)驗(yàn)選擇Sevag試劑中氯仿-正丁醇的體積比分別為5:1、4:1、3:1，除蛋白的次數(shù)分別為2、3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 pH值對大豆多糖得率的影響

稱取20g干豆渣，按液料比25:1(mL/g)加入90℃蒸餾水，調(diào)pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，在60℃、200W功率條件下超聲處理40min，結(jié)果見圖1。

圖1 pH值對大豆多糖得率的影響Fig.1 Effect of pH on extraction rate of soybean polysaccharides

結(jié)果表明，當(dāng)pH值為3時(shí)，大豆多糖的得率較低，主要是因?yàn)榇蠖苟嗵请m屬酸性多糖，但在酸性較強(qiáng)的條件下，易導(dǎo)致其中某些鍵或側(cè)鏈的斷裂，從而造成得率較低。當(dāng)pH值為4.5時(shí)，多糖的得率達(dá)到最大。故pH值選定在4.5為最佳。

2.1.2 液料比對大豆多糖得率的影響

稱取20g干豆渣，按液料比10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1加入90℃的蒸餾水，調(diào)至pH4.5，在60℃、200W功率條件下超聲處理40min。

圖2 液料比對大豆多糖得率的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of soybean polysaccharides

由圖2可知，液料比在10:1～25:1之間時(shí)，大豆多糖得率上升最為迅速。液料比高于25:1時(shí)，多糖的得率趨于穩(wěn)定，變化幅度不大。這是由于大豆多糖從細(xì)胞到溶劑是一個(gè)由濃度差推動(dòng)的擴(kuò)散過程，溶劑用量越多細(xì)胞內(nèi)外的濃度差就越大。當(dāng)溶劑增加到一定程度之后再增加溶劑用量并不會(huì)明顯提高多糖的得率。

2.1.3 熱水提取溫度對大豆多糖得率的影響

稱取20g干豆渣，按液料比25:1加入蒸餾水，蒸餾水溫度分別為60、70、80、90、100℃，調(diào)至pH4.5、60℃、200W功率條件下超聲處理40min。

圖3 提取溫度對大豆多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of soybean polysaccharides

由圖3可知，多糖得率隨提取溫度的升高不斷提高，因?yàn)樘崛囟壬邥?huì)加快溶液的擴(kuò)散速率，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的多糖物質(zhì)向外擴(kuò)散。提取溫度為90℃時(shí)得率達(dá)到最大，由于大于100℃提取需要壓力設(shè)備，不僅會(huì)使提取成本增加，而且提取溫度過高還會(huì)破壞大豆多糖的結(jié)構(gòu)，故提取溫度選擇90℃為宜。

2.1.4 超聲波功率對大豆多糖得率的影響

本實(shí)驗(yàn)頻率保持在45kHz，選用不同的功率進(jìn)行提取。稱取20g干豆渣，按液料比25:1加入90℃蒸餾水，調(diào)至pH4.5，在60℃，50、100、150、200、250、300W條件下超聲處理40min。

圖4 超聲波功率對大豆多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction rate of soybean polysaccharides

由圖4可知，當(dāng)功率較小時(shí)，大豆多糖的得率隨著超聲波功率的提高而提高，因?yàn)榧哟蟪暡üβ剩暱栈饔眉訌?qiáng)，機(jī)械剪切作用也加強(qiáng)，有助于細(xì)胞多糖的溶出。但當(dāng)功率達(dá)到一定程度(200W)時(shí)，功率再進(jìn)一步提高，得率反而呈下降趨勢。這是因?yàn)楣β蔬^大可能會(huì)使多糖分子降解程度加大，故超聲波功率以150～200W為宜。

2.1.5 超聲波輻射時(shí)間對大豆多糖得率的影響

稱取20g干豆渣，按液料比25:1加入90℃的蒸餾水，調(diào)至pH4.5，在60℃、200W的功率條件下超聲處理 10、20、30、40、50、60min。

圖5 超聲波輻射時(shí)間對大豆多糖得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic treatment time on extraction rate of soybean polysaccharides

從圖5可知，超聲波輻射時(shí)間少于40min時(shí)，超聲波輻射時(shí)間越長，多糖得率越高。處理40min時(shí)多糖得率達(dá)到最大。超聲波輻射時(shí)間再延長，多糖得率開始下降，究其原因可能是由于超聲波較強(qiáng)的機(jī)械剪切作用，長時(shí)間處理不僅會(huì)使大分子多糖降解，同時(shí)也使蛋白質(zhì)等其他雜質(zhì)開始溶出，得到的多糖含量下降。故用超聲波處理多糖浸提液的時(shí)間以40min為宜。

2.2 大豆多糖提取正交試驗(yàn)

超聲波輔助提取大豆多糖時(shí)，超聲波處理溫度以60℃為宜。實(shí)驗(yàn)顯示，高于60℃易使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，而且會(huì)使部分多糖水解為單糖或低聚糖，多糖得率反而下降。故提取過程中超聲波處理溫度60℃為宜。

在超聲波處理溫度60℃、熱水溫度90℃條件下，以大豆多糖得率作為評價(jià)指標(biāo)，選取對得率有較大影響的超聲波功率、超聲波輻射時(shí)間、液料比、pH值4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，確定最佳提取工藝條件，結(jié)果見表2。

表2 大豆多糖提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Scheme and results of orthogonal array design

從表2可以看出，超聲波功率(A)、超聲波輻射時(shí)間(B)、液料比(C)、pH值(D)對大豆多糖得率影響的大小順序是B＞C＞D＞A；根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果最佳工藝條件為A2B3C1D2，即超聲波功率200W、超聲波輻射時(shí)間40min、液料比20:1、pH4.5，此時(shí)多糖得率為8.82%。

2.3 粗多糖的純化

將正交試驗(yàn)提取的粗多糖進(jìn)行純化。將按最佳提取條件所獲粗多糖用不同比例Sevag試劑純化，以期獲得最佳品質(zhì)多糖，具體見表3。結(jié)果表明，Sevag試劑配方中氯仿與正丁醇的比值較小，且萃取的次數(shù)較多時(shí)，對提高純化多糖回收率有利。最佳萃取條件為氯仿與正丁醇體積比為3:1，且萃取3次時(shí)，純化多糖的回收率達(dá)到60.30%。

表3 Sevag試劑配方與純化多糖回收率的關(guān)系Table 3 Relationship between Sevag reagent formula and extraction rate of soybean polysaccharides

2.4 傳統(tǒng)的熱水浸提法與超聲波輔助提取法比較

表4 兩種方法比較結(jié)果Table 4 Comparison of extraction rates between two extraction methods

由表4可知，與傳統(tǒng)的熱水浸提法相比，超聲波輔助提取可顯著提高大豆多糖的得率，明顯縮短提取時(shí)間，同時(shí)又降低能量消耗，所以該方法是輔助提取多糖的好方法，具有快速、節(jié)能、高效等優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié) 論

超聲波輔助提取大豆多糖的最佳工藝條件為提取pH4.5、熱水溫度90℃、液料比20:1、超聲波功率200W、超聲波提取時(shí)間40min、超聲波提取溫度60℃，此時(shí)水溶性大豆多糖的得率為8.82%。

純化粗多糖的最佳條件為Sevag試劑中氯仿與正丁醇的比例3:1、萃取3次，此時(shí)蛋白脫除效果較好，多糖損失也較少，所得純化產(chǎn)物中多糖的回收率最高，達(dá)到60.30%。

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Ultrasonic-assisted Extraction and Purification of Water-soluble Polysaccharides from Soybean Dregs

CHEN Hong，ZHANG Bo，LIU Xiu-qi，LI Hong，WANG Da-wei*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Skimmed extruded soybean dregs were used as the raw material to prepare water-soluble polysaccharides through the steps of ultrasonic-assisted extraction and purification by Sevag's method. The optimal ultrasonic-assisted extraction parameters were found to be extraction pH of 4.5, temperature of 90 ℃, material/liquid ratio of 1:20 (g/mL), ultrasonic power of 200 W, and ultrasonic extraction time of 40 min. Under these optimal extraction conditions, the extraction rate of watersoluble soybean polysaccharides was up to 8.82%. The purification of crude polysaccharides was achieved by treating with a Sevag reagent composed of CHCl3 andn-butanol (3:1,V/V) 3 times. The recovery rate of purified polysaccharides was up to 60.30%.

skimmed extruded soybean dregs；water-soluble soybean polysaccharide；ultrasonic extraction；purification

TS214.2

A

1002-6630(2011)06-0139-04

2010-07-11

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)研究啟動(dòng)基金項(xiàng)目(2009-6)

陳紅(1976—)，女，講師，博士，主要從事食品營養(yǎng)與功能食品開發(fā)研究。E-mail：chenhong216@yahoo.com.cn

*通信作者：王大為(1960—)，男，教授，博士，主要從事功能食品開發(fā)研究。E-mail：xcpyfzx@163.com