張 穎，Gary Guishan Xiao，榮培晶，劉梅潔，汪文萊，王少君，于智敏，劉 紅，潘靜華，于 崢，趙宏艷，鞠大宏△

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700;2.Osteoporosis Research Center，Creighton University，USA;3.中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所，北京 100700)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)是一種與衰老有關(guān)的常見病，主要發(fā)生在絕經(jīng)后婦女。由于雌激素缺乏導(dǎo)致骨量減少及骨組織結(jié)構(gòu)變化，伴有骨脆性增加及易導(dǎo)致骨折的一種慢性疾病，屬中醫(yī)“痹證”、“骨痿”等范疇。中藥杜仲、千年健均有補腎健骨的作用。如《神農(nóng)本草經(jīng)》記載杜仲藥效為“補中，益精氣，堅筋骨……久服輕身耐老”?！讹嬈聟ⅰ酚涊d千年健的功效為“強筋骨，治肢節(jié)酸疼”?；谝陨险J(rèn)識，本實驗以去卵巢大鼠為模型，以探討杜仲和千年健對骨質(zhì)疏松癥的治療作用和機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用雌性 Wistar大鼠72只，清潔級，體重230g～270g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供(動物許可證號SCXK-(軍)2002-001)。動物于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級實驗動物室內(nèi)飼養(yǎng)(實驗動物室許可證號SYXK(京)-2005-0024)。

1.1.2 藥物 杜仲購自四川省宜賓市中宏藥業(yè)有限公司，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所生藥室鑒定，為杜仲科(Eucomiaceae)杜仲屬杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹皮。千年健購自廣西平安堂藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所生藥室鑒定，為天南星科(Araceae)千年健屬千年健 Homalomena occulta(Lour.)Schott的干燥根莖。以上各藥加水煎煮，藥液濃縮至1g生藥/ml的濃度。

1.1.3 主要試劑 大鼠護骨素 (Osteoprotegerin，OPG)、細(xì)胞核因子-κB 受體活化因子配基(Receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)免疫組化試劑盒:美國 Santa cruze;大鼠 OPG、RANKL原位雜交試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供;鹽酸四環(huán)素由欣惠澤奧科技有限公司公司提供。

1.1.4 主要儀器 OM2563冰凍切片機:美國TBS公司;Reicheit-Jung2040切片機:德國;Qwin圖像分析儀系統(tǒng):德國Leica公司;Wellwash 4 Mk2洗板機:美國 Thermo公司;Multiskan Mk3酶標(biāo)儀:美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理 選將72只大鼠隨機分為3組，其中空白對照組12只，假手術(shù)組12只和造模組48只。造模組大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后摘除雙側(cè)卵巢［1］，假手術(shù)組只摘取少量脂肪組織。術(shù)后1個月再將造模組大鼠隨機分為模型組、陽性對照組、杜仲組、千年健組4組，每組12只。然后開始灌胃給藥，杜仲組、千年健組為1g生藥/mL的水煎劑，給藥體積為5.6mL/kg體重，即給藥劑量均為5.6g生藥/kg體重;陽性對照組給予0.008mg/mL己烯雌酚，給藥體積為 5.6mL/kg體重，即給藥劑量為0.0448mg/kg體重?？瞻讓φ战M、假手術(shù)組、模型組則灌服等體積的蒸餾水。以上灌胃給藥3個月，1d 1次，連續(xù)6d，休息1d。大鼠處死前15d和前3d腹腔注射鹽酸四環(huán)素30mg/kg體重，對骨進行熒光標(biāo)記。給藥結(jié)束后，各組大鼠以45mg/kg劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，股動脈取血。大鼠處死后取右側(cè)脛骨制作不脫鈣骨切片，取左側(cè)脛骨制作脫鈣的冰凍切片。

1.2.2 指標(biāo)的檢測方法 骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)的測定:取右側(cè)脛骨近端1/3，除凈周圍附著的軟組織，采用塑料包埋方法制作不脫鈣骨切片:一張切片進行甲苯胺藍染色，另一張切片直接用于熒光觀察。采用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)，按章明放等人的方法對不脫鈣骨切片進行形態(tài)計量［2］。

成骨細(xì)胞(OB)和骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSC)OPG、RANKL蛋白及其mRNA表達的檢測:取左側(cè)脛骨近端1/3，按照文獻［3］中所述方法進行標(biāo)本處理，采用免疫組化方法檢測OB和MSC OPG、RANKL蛋白的表達，采用原位雜交法檢測其mRNA表達。并用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)對OPG、RANKL蛋白及其mRNA表達陽性密度進行計量。

2 結(jié)果

2.1 杜仲、千年健對卵巢切除大鼠脛骨骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)的影響

2.1.1 杜仲、千年健對卵巢切除大鼠脛骨骨小梁體積百分比(TBV%)的影響 表1顯示，模型組大鼠脛骨TBV%較假手術(shù)組明顯降低。杜仲組、千年健組TBV%顯著高于模型組，明顯低于假手術(shù)組。陽性對照組TBV%顯著高于模型組，與假手術(shù)組相比無顯著性差異。

表1 各組大鼠脛骨TBV%的變化

2.1.2 杜仲、千年健對卵巢切除大鼠脛骨骨小梁吸收表面百分比(TRS%)的影響 表2顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脛骨 TRS%顯著升高。杜仲組、千年健組TRS%明顯低于模型組，明顯高于假手術(shù)組。與模型組相比，陽性對照組TRS%顯著降低，與假手術(shù)組相比無顯著性差異。

2.1.3 杜仲、千年健對卵巢切除大鼠脛骨骨小梁形成表面百分比(TFS%)、骨小梁礦化率(MAR)的影響

表2 各組大鼠脛骨TRS%的變化

表3顯示，模型組大鼠脛骨 TFS%、MAR較假手術(shù)組顯著增高，千年健組TFS%、MAR明顯低于模型組，而杜仲組無顯著性變化。與假手術(shù)組相比，杜仲組、千年健組 TFS%、MAR明顯增高。陽性對照組TFS%、MAR與模型組相比明顯降低，與假手術(shù)組相比無顯著性差異。

2.1.4 杜仲、千年健對卵巢切除大鼠脛骨骨皮質(zhì)礦化率(mAR)和骨皮質(zhì)類骨質(zhì)平均寬度(OSW)的影響 表4顯示，模型組大鼠脛骨mAR和OSW皆高于假手術(shù)組。與模型組相比，千年健組和OSW明顯降低，mAR無顯著性差異，杜仲組mAR和OSW均無顯著性改變;與假手術(shù)組相比，杜仲組和千年健組mAR明顯升高，OSW均無顯著性差異。陽性對照組的mAR和OSW與模型組比較，顯著降低，與假手術(shù)組相比無顯著性差異。

表3 各組大鼠脛骨TFS%和MAR的變化

表4 各組大鼠脛骨mAR和OSW的變化

2.2 杜仲、千年健對卵巢切除大鼠脛骨 OB、MSC OPG和RANKL蛋白表達的影響

2.2.1 杜仲、千年健對卵巢切除大鼠脛骨 OB和MSC OPG蛋白表達的影響 表5顯示，模型組大鼠脛骨OB和MSC OPG蛋白表達陽性密度均明顯低于假手術(shù)組。與模型組相比，千年健組 OB和MSC OPG蛋白表達均明顯升高，杜仲組無顯著性差異;與假手術(shù)組相比，杜仲組、千年健組OB和 MSC OPG蛋白表達陽性密度均明顯降低。陽性對照組OB和MSC OPG蛋白表達陽性密度均明顯高于模型組，與假手術(shù)組相比無顯著性差異。

表5 各組大鼠脛骨OB和MSC OPG蛋白表達的變化

2.2.2 杜仲、千年健對卵巢切除大鼠脛骨 OB和MSC RANKL蛋白表達的影響 表6顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脛骨OB和MSC RANKL蛋白表達陽性密度均明顯升高。與模型組相比，杜仲組、千年健組 OB和 MSC RANKL蛋白表達明顯降低。與假手術(shù)相比，杜仲組MSC RANKL蛋白表達陽性密度升高，OB RANKL蛋白表達無顯著性差異;千年健組OB和MSC RANKL蛋白表達陽性密度較假手術(shù)組均明顯升高。與模型組相比，陽性對照組OB和MSC RANKL蛋白表達陽性密度明顯降低，與假手術(shù)組相比無顯著性差異。

表6 各組大鼠脛骨OB和MSC RANKL蛋白表達的變化

2.3 杜仲、千年健對卵巢切除大鼠脛骨 OB和MSC OPG和RANKL mRNA表達的影響

2.3.1杜仲、千年健對卵巢切除大鼠脛骨OB和MSC OPG mRNA表達的影響 表7顯示，模型組大鼠脛骨OB和MSC OPG mRNA表達陽性密度較假手術(shù)組顯著降低。千年健組OB和MSC OPG mRNA的陽性密度明顯高于模型組，而杜仲組則無顯著性變化。與假手術(shù)組相比，杜仲組、千年健組 OB和MSC OPG mRNA表達均明顯降低。陽性對照組OB和MSC OPG mRNA表達較模型組明顯升高，與假手術(shù)組相比無顯著性差異。

表7 各組大鼠脛骨OB和MSC OPG mRNA表達的變化

2.3.2 杜仲、千年健對卵巢切除大鼠脛骨 OB和MSC RANKL mRNA表達的影響 表8顯示，模型組大鼠脛骨OB和MSC RANKL mRNA表達陽性密度均明顯高于假手術(shù)組。與模型組相比，杜仲組、千年健組OB和MSC RANKL mRNA表達均明顯降低;與假手術(shù)組相比，千年健組 MSC RANKL mRNA表達陽性密度明顯升高，杜仲組OB和MSC RANKL mRNA表達以及千年健組OB RANKL mRNA表達均無顯著性差異。陽性對照組OB和MSC RANKL mRNA表達陽性密度均明顯低于模型組，與假手術(shù)組相比無顯著性差異。

表8 各組大鼠脛骨OB和MSC RANKL mRNA表達的變化

與空白對照組比較，假手術(shù)組的上述指標(biāo)均無顯著性差異，從而排除了手術(shù)本身對實驗的影響。

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是由于絕經(jīng)后雌激素迅速減少致使骨量丟失加快［4］。本研究以卵巢切除大鼠為模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢切除后大鼠脛骨TBV%顯著降低，代表骨吸收參數(shù)的TRS%和代表骨形成參數(shù)的TFS%、MAR、mAR和 OSW 均顯著增高，因此本實驗?zāi)Ｐ团c人類絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機理相似，為骨吸收大于骨形成的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥模型。給藥3個月后，杜仲組的TBV%和TRS%均有明顯逆轉(zhuǎn);千年健組除mAR以外，其他指標(biāo)均明顯逆轉(zhuǎn)。由此可見，杜仲主要以降低骨吸收來達到對骨質(zhì)疏松癥的治療，而千年健既能抑制骨吸收，同時又能抑制骨形成，使骨形成大于骨吸收而達到對骨質(zhì)疏松癥的治療作用。

模型組大鼠脛骨OB和MSC OPG蛋白及其mRNA的表達均明顯低于假手術(shù)組，OB和 MSC RANKL蛋白及其mRNA的表達均明顯高于假手術(shù)組，提示當(dāng)雌激素缺乏時則抑制OB和MSC OPG蛋白表達減少，但促進 RANKL蛋白的表達。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，OPG、RANKL是非常重要的破骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)信號因子。OPG對破骨細(xì)胞的作用是多方面的，它可以抑制破骨細(xì)胞的分化、融合、激活，并促進破骨細(xì)胞凋亡。RANKL是直接刺激破骨細(xì)胞發(fā)育和使之激活的細(xì)胞因子，它與破骨細(xì)胞表面受體RANK結(jié)合，強有力地促進破骨細(xì)胞的形成、分化、成熟，并抑制破骨細(xì)胞凋亡，延長其存活［5］。本實驗結(jié)果顯示，杜仲組、千年健組 OB和MSC RANKL蛋白及其mRNA的表達較模型組均明顯降低，提示杜仲和千年健對大鼠脛骨OB和MSC RANKL蛋白及其mRNA的表達有明顯的抑制作用;同時，千年健組OB和MSC OPG蛋白及其mRNA表達較模型組均明顯提高，表明千年健對OB和MSC OPG蛋白及其mRNA表達有一定的促進作用。

綜上所述，杜仲、千年健對卵巢切除所致的大鼠骨質(zhì)疏松癥均具有一定的治療作用。從治療作用環(huán)節(jié)來看兩者各有特點:千年健不僅可以增加OB和MSC OPG蛋白及其 mRNA表達，還能抑制RANKL蛋白及其 mRNA的表達;杜仲是通過抑制 OB和MSC RANKL蛋白及其mRNA表達，從而達到治療骨質(zhì)疏松癥的目的。

［1］鞠大宏，張春英，王安民，等.溫補腎陽方對去卵巢所致骨質(zhì)疏松癥大鼠IL-1和IL-6活性的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2000，6(4):29-32.

［2］章明放，張乃鑫，譚郁彬.運動對雌性大鼠去勢后骨質(zhì)疏松癥的作用［J］.中華骨科雜志，1994，14(6):365-369.

［3］鞠大宏，于福祿，張麗坤，等.滋陰補腎法對卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞COX-2蛋白和 mRNA表達的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2006，12(12):918-920.

［4］馬俊嶺，郭海英，侯欽午.絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的病因病理［J］.淮海醫(yī)藥，2010，28(5):3-4.

［5］劉梅潔，鞠大宏，趙宏艷.“腎主骨”的機理研究—左歸丸含藥血清對破骨細(xì)胞分化調(diào)控因子OPG、RANKL蛋白表達的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15(3):184-187.