張麗敏,華艷艷,孫玉梅,曹 芳

(1.大連工業(yè)大學生物工程學院,遼寧大連 116034;2.大連市農(nóng)業(yè)科學研究院,遼寧大連 116036)

紅發(fā)夫酵母生物合成蝦青素天然促進劑的研究

張麗敏1,華艷艷2,孫玉梅1,曹 芳1

(1.大連工業(yè)大學生物工程學院,遼寧大連 116034;2.大連市農(nóng)業(yè)科學研究院,遼寧大連 116036)

在搖瓶發(fā)酵過程中添加富含蝦青素合成前體的果蔬汁及茶汁,考察了添加劑對蝦青素合成的影響.結果表明:在適當?shù)陌l(fā)酵時間添加橙汁、綠茶汁和番茄汁能明顯促進細胞生長及蝦青素合成,最高蝦青素產(chǎn)量和細胞蝦青素含量可分別比對照提高 124%和 128%;添加菠菜汁導致細胞蝦青素含量有所降低.

紅發(fā)夫酵母;蝦青素;促進劑

0 前言

蝦青素屬于酮式類胡蘿卜素,呈艷紅色,它具有獨特的著色功能、極強的抗氧化性,在抗癌變、增強免疫和抗光敏等生物學功能上遠強于其他類胡蘿卜素,因而在飼料、食品、化妝品及醫(yī)藥等領域具有廣闊的應用前景[1-2].目前認為紅發(fā)夫酵母 (Phaffia rhodozym a)是實現(xiàn)發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)蝦青素最具潛力的菌種之一[3].

開發(fā)廉價的培養(yǎng)原料、降低發(fā)酵成本是紅發(fā)夫酵母產(chǎn)蝦青素研究的主要內(nèi)容之一.從蝦青素生物合成途徑可知,番茄紅素、β-胡蘿卜素等是蝦青素合成的重要前體[4],如 Johnson等[5]在培養(yǎng)液中加入番茄汁,使蝦青素含量提高到 0.814 mg/g干細胞.胡榮鎖等[6]發(fā)現(xiàn),西瓜汁可提高蝦青素產(chǎn)量,以 10%的西瓜汁為原料時蝦青素產(chǎn)量較高.自然界中許多綠色植物中類胡蘿卜素含量都很高,作者選用幾種類胡蘿卜素含量較高的常見果蔬及茶葉為原料,于不同發(fā)酵時期定量添加這些果蔬汁及飲料,考察它們對紅發(fā)夫酵母生物合成蝦青素的影響,以期尋找到成本低廉的蝦青素合成促進劑.

1 材料與方法

1.1 菌種

紅發(fā)夫酵母 (Phaffia rhodozym a)AS 2.1557:中國科學院微生物研究所.

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:葡萄糖 10 g,麥芽汁 (10oBx)3 g,蛋白胨 5 g,酵母膏 3 g,自來水 1 L,pH 6.0.

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 20 g,(NH4)2SO45 g,KH2PO41 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,CaCl20.1 g,酵母膏 1 g,自來水 1 L,pH6.0.

1.3 培養(yǎng)方法

液體種子:將 2環(huán)菌苔接種于裝有 25 mL種子培養(yǎng)基的 250 mL三角瓶,于 22℃、210 r/min振蕩培養(yǎng) 48 h.

搖瓶發(fā)酵:將 2 mL種子液接入裝有 23 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的 250 mL三角瓶,于 22℃、210 r/min振蕩培養(yǎng),定期取樣測定.

1.4 測定方法

1.4.1 生物量測定

采用比濁法[7]:取 1 mL發(fā)酵液,用純凈水稀釋,并以除去菌體的發(fā)酵液作空白,測定 500 nm波長下的吸光值.

1.4.2 蝦青素提取及測定

二甲基亞砜法[8]:取 2 mL發(fā)酵液離心,收集菌體,洗滌 2次,用 1 mL二甲基亞砜 (55℃)破壁,加入 5 mL丙酮提取,3 000 r/min離心 10 min,收集上清液,以二甲基亞砜與丙酮混合液(體積比 1︰5)為空白,測定 480 nm波長下的吸光值.蝦青素產(chǎn)量和細胞蝦青素含量按以下公式計算:影響較小.在 0 h和 24 h比在 48 h添加橙汁對細胞生長及蝦青素合成更有利.

式中:Va為萃取液體積 (mL);A為 480 nm波長下的吸光值;E為比消光系數(shù),即為2 150;Vb為發(fā)酵液取樣體積 (mL);G為 VbmL發(fā)酵液中的細胞干重 (g);10 000,10為單位換算后的余數(shù).

1.4.3 還原糖含量測定

采用 DNS法[9].

1.5 果蔬汁添加液的制備

橙汁 (或番茄汁):鮮橙 (或新鮮紅番茄)去皮、榨汁、過濾,收集濾液、滅菌.無菌過濾除去沉淀,得橙黃色橙汁 (或橙紅色番茄汁),測定還原糖含量,于 4℃存放、備用.

菠菜汁:新鮮菠菜去根和黃葉,洗凈、晾干、稱重,700 g菠菜加入 300 mL自來水榨汁、過濾,收集濾液、滅菌.無菌過濾除去固形物,得淺綠色菠菜汁,于 4℃存放、備用.

綠茶汁:綠茶 100 g,加入 55℃自來水 200 mL,于 55℃恒溫浸泡 3 h,過濾,收集濾液、滅菌.無菌過濾除去沉淀,得黃綠色茶汁,于 4℃存放、備用.

以上濾液和對照 (自來水)均于 115℃滅菌20 min.

2 結果與分析

2.1 添加橙汁或菠菜汁對蝦青素生物合成的影響

分別于搖瓶發(fā)酵至 0、24、48 h時添加 2 mL橙汁或菠菜汁,于發(fā)酵 60 h和 72 h時取樣測定.結果見圖 1和圖 2.

由圖 1可知,分別在發(fā)酵 0、24、48 h時添加橙汁,發(fā)酵 60 h和 72 h的細胞產(chǎn)量可分別提高54.4%和 49.9%、48.4%和 46.5%、29.3%和36.1%;蝦青素產(chǎn)量分別提高 65.5%和 50.9%、71.1%和 43.6%、44.4%和 46.1%;細胞蝦青素含量可分別提高 7.2%和 0.38%、15.2%和-2.3%、11.7%和 7.0%.可見,與對照組相比,在發(fā)酵 0～48 h添加橙汁,使蝦青素產(chǎn)量提高的幅度較大,細胞產(chǎn)量次之,而對細胞蝦青素含量的

由圖 2可知,分別在發(fā)酵 0、24、48 h時添加菠菜汁,發(fā)酵 60 h和 72 h的細胞產(chǎn)量可分別提高35.0%和 44.7%、15.4%和 15.5%、6.47%和14.6%;蝦青素產(chǎn)量可分別提高 14.6%和12.6%、10.6%和 6.3%、-13.9%和 -3.66%;而細胞蝦青素含量則分別降低 8.3%和 15.0%、2.1%和 5.4%、8.0%和 10.8%.可見,在發(fā)酵 0～48 h添加菠菜汁,均使細胞蝦青素含量明顯降低.在 0 h和 24 h添加菠菜汁對提高細胞和蝦青素的產(chǎn)量較有利;在 48 h添加菠菜汁,蝦青素的合成明顯受到抑制.

總體上看,添加菠菜汁不如橙汁對蝦青素的生物合成有利.分析原因可能是:其一,菠菜含糖量較少,而橙子中則含有豐富的葡萄糖、果糖、蔗糖等[10](經(jīng)測定可知,2 mL橙汁可使 25 mL培養(yǎng)基含糖量增加約 4.0 g/L),在補加橙汁的同時也起到了補糖的作用,因而橙汁更能促進菌體生長;其二,橙汁中除含有類胡蘿卜素 (含 0.55 mg/100 g)外,還含有維生素、蘋果酸、檸檬酸等物質(zhì),其中檸檬酸可能是蝦青素合成過程中潛在的前體[11],而菠菜中雖然類胡蘿卜素含量很高 (含3.87 mg/100 g)[10],但同時還含有較多的草酸和無機鹽,制備菠菜汁時,滅菌后出現(xiàn)大量墨綠色的結塊,會損失較多的營養(yǎng)物質(zhì);其三,菠菜汁中可能含有某些抑制蝦青素合成的特殊物質(zhì),因此,以后的研究應注意改進菠菜汁的制備工藝,以除去原料中的抑制性物質(zhì).

2.2 添加綠茶汁或番茄汁對蝦青素生物合成的影響

分別于搖瓶發(fā)酵至 0、24、48 h時添加 2 mL綠茶汁或番茄汁,每隔 12 h取樣測定.結果見表1.

表1 添加綠茶汁或番茄汁對蝦青素生物合成的影響

由表1可知,在 0 h添加綠茶汁,發(fā)酵周期不變,細胞產(chǎn)量提高 43%,蝦青素產(chǎn)量略有提高,而細胞蝦青素含量略有下降;在 0 h添加番茄汁,細胞產(chǎn)量雖較高,但達到最大值的時間拖后 36 h,且蝦青素合成明顯受到抑制.在 24 h和 48 h添加綠茶汁或番茄汁,均能不同程度促進菌體生長及蝦青素合成.在 24 h添加綠茶汁,發(fā)酵周期縮短 12 h;在 48 h添加綠茶汁,對細胞產(chǎn)量影響不大,但明顯促進蝦青素合成,發(fā)酵周期延長 24 h時,最高蝦青素產(chǎn)量和細胞蝦青素含量可分別提高124%和 128%;在 24 h和 48 h添加番茄汁,發(fā)酵周期分別延長 48 h和 24 h.可見,在發(fā)酵 48 h時(經(jīng)測定此時發(fā)酵液殘?zhí)且呀抵凛^低水平)添加綠茶汁或番茄汁,比在 0 h或 24 h時添加更能有效促進細胞生長及蝦青素合成.

分析可知,番茄汁中不但含有一定量的糖 (2 mL番茄汁可使 25 mL培養(yǎng)基含糖量增加約 1.6 g/L),還含有番茄紅素以及較多的有機酸,這些物質(zhì)均可促進菌體的生長和代謝[12].但較特殊的是,在 0 h添加番茄汁會大大降低蝦青素的合成能力,這可能是由于番茄紅素的存在而使得蝦青素的合成受阻,菌體在利用番茄汁進行生長的同時合成了其他代謝產(chǎn)物.而綠茶中不僅類胡蘿卜素含量較高 (含 5.46 mg/100 g),而且還含有較多的類黃酮類物質(zhì),其中β-紫羅蘭酮是β-胡蘿卜素的末端環(huán)類似物[13],這些物質(zhì)可能被菌體利用直接用于合成蝦青素.

3 討論

以上 4種果蔬汁的添加效果表明,以綠茶汁作蝦青素合成促進劑具有極為樂觀的應用前景;橙汁和番茄汁的添加效果較好,菠菜汁的制備方法還有待于改進.另外,很多研究表明,茶樹鮮葉[14-15]可作為原料提取β-D-葡萄糖苷酶 (EC 3.2.1.21).該酶同樣存在于紅發(fā)夫酵母細胞內(nèi),并可通過調(diào)節(jié)其活性而使酵母的細胞壁發(fā)生變化[16].因而,可考慮以新鮮茶樹葉作為原料,經(jīng)適當處理后在紅發(fā)夫酵母培養(yǎng)過程中適量添加,有望在促進蝦青素合成及減弱酵母細胞壁合成上獲得雙重效果.

[1] 王菊芳,吳振強,梁世中.蝦青素的生理功能及其應用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2000,26(2):66-69.

[2] 裘暉,朱曉立.蝦青素的結構與功能[J].食品工程,2007(1):16-18.

[3] 耿華田.蝦青素簡介[J].化學教育,2007(3):5-7.

[4] 賈立壯,王遠山,鄭裕國.紅發(fā)夫酵母積累蝦青素的代謝調(diào)控機理研究進展 [J].微生物學通報,2008,35(1):103-106.

[5] Johnson E A,LewisM J.Astaxanthin for mation by the yeastPhaffia rhodozym a[J].Journal of General Microbiology,1979,115(1):173-183.

[6] 胡榮鎖,楊勁松,楊瑞,等.蝦青素果汁飲料的研究 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2010,38(2):906-907.

[7] Ramirez J,Gutierrez H,GschaedlerA.Optimization of astaxanthin production byPhaffia rhodozym athrough factorial design and response surface methodology[J].Journal of Biotechnology,2001,88(3):259-268.

[8] Sedmak J J,Weerasinghe D K,Jolly S O.Extraction and quantitation of astaxanthin from Phaffia rhodozym a[J]. Biotechnol Techniques,1990,4(2):107-112.

[9] 袁道強,黃建華.生物化學實驗與技術[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2006:126-127.

[10]吳成福.現(xiàn)代膳食營養(yǎng)手冊[M].鄭州:河南科學技術出版社,2003:119-120,133,139.

[11]Flores C L B,Martín R S S.Citrate,a possible precursorof astaxanthin in Phaffia rhodozym a:influence of varying levels of ammonium,phosphate and citrate in a chemically defined medium[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2001,55(3):341-347.

[12]朱曉立,梁世中,鄧毛程.不同時間流加番茄汁對紅發(fā)夫酵母生產(chǎn)蝦青素的影響[J].食品工業(yè)科技,2008,29(11):95-97.

[13]孫乃霞,趙學明.紅發(fā)夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的研究進展 [J].化學工業(yè)與工程,2007,24(4):339-344.

[14]王迎春,李春華,劉曉軍,等.茶葉中β-葡萄糖苷酶研究進展 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2008,36(10):4151-4153,4206.

[15]王華夫,游小青.茶葉中β-葡萄糖苷酶活性的測定[J].中國茶葉,1996(3):16-17.

[16]Pera L M,Rubinstein L,BaigoriM D.Influence ofmanganese on cellmorphology,protoplasts formation andβ-D-glucosidase activity inPhaffia rhodozym a[J].FEMSMicrobiologyLetters,1999,171(2):155-160.

STUDY ON NATURAL PROMOTER FOR ASTAXANTH IN B I OSYNTHESIS BY USE OFPHAFFIA RHODOZYMA

ZHANGLi-min1,HUA Yan-yan2,SUN Yu-mei1,CAO Fang1
(1.School of B iological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian116034,China)(2.Dalian Academ y of Agriculture Sciences,Dalian116036,China)

The paper studied the effects of additives on the synthesis of astaxanthin by adding fruit-vegetable juice and tea juice rich in synthetic precursor of astaxanthin during shaking flask fer mentation.The results showed that the orange juice,green tea juice and tomato juice added in the proper fermentation time could remarkably promote the cell growth and the synthesis of astaxanthin;the highest astaxanthin yield and the astaxanthin content in cellswere respectively i mproved by 124%and 128%in comparison with the control group;and the addition of spinach juice resulted in the reduction of the astaxanthin content in cells.

Phaffia rhodozym a;astaxanthin;promoter

TS202.3

B

1673-2383(2011)01-0066-04

2010-10-28

張麗敏 (1983-),女,山東威海人,碩士研究生,研究方向為微生物代謝控制發(fā)酵.