柳 華,賀磊磊,楊 翼

(1武漢體育學(xué)院 健康科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430079;2武漢體育學(xué)院 研究生部,湖北 武漢 430079)

超負(fù)荷訓(xùn)練致心臟結(jié)構(gòu)改變及心肌細(xì)胞過度凋亡的實(shí)驗(yàn)研究＊

柳 華1,賀磊磊2,楊 翼2

(1武漢體育學(xué)院 健康科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430079;2武漢體育學(xué)院 研究生部,湖北 武漢 430079)

目的:觀察超負(fù)荷訓(xùn)練對心臟結(jié)構(gòu)及心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法:根據(jù)超負(fù)荷概念建立超負(fù)荷訓(xùn)練動物模型,訓(xùn)練8周后運(yùn)用組織學(xué)、透射電鏡、TUNEL法觀察心臟結(jié)構(gòu)變化及心肌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:超負(fù)荷訓(xùn)練可致心肌纖維腫脹,排列紊亂,部分?jǐn)嗔鸭熬衷顮顗乃?線粒體大小不一,空泡化,染色質(zhì)邊集等現(xiàn)象;超負(fù)荷訓(xùn)練后心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯多于對照組,與正常大鼠相比差異有顯著性(P＜0.05)。且隨著訓(xùn)練時(shí)間延長心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)不斷增高,訓(xùn)練組4、6、8周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較均存在顯著性差異(p＜0.05)。結(jié)論:超負(fù)荷訓(xùn)練可使大鼠心肌出現(xiàn)結(jié)構(gòu)性損壞,其原因與超負(fù)荷訓(xùn)練致心肌細(xì)胞過度凋亡有關(guān);根據(jù)超負(fù)荷概念建立超負(fù)荷訓(xùn)練動物模型達(dá)到了超負(fù)荷訓(xùn)練的標(biāo)準(zhǔn),為進(jìn)一步研究超負(fù)荷訓(xùn)練對機(jī)體的影響打下了良好的基礎(chǔ)。

超負(fù)荷訓(xùn)練;;心臟結(jié)構(gòu);心肌;凋亡

AbstractThe overly trained animal model is established according to the overload concept and the cardiac structure change and the apoptosis of myocardial cells are observed with the histology,the transmission electron microscopy and TUNEL.The over training can cause swelling,disorder,break and focal shape necrosis of the myocardial fibers as well as the different mitochondria sizes,vacuoles and chromatin change.The apoptosis of the myocardial cells after the over training is more than that of the comparative groups and is different with that of the normal mouses(P＜0.05).The longer the over training time,the more the apoptosis of the myocardial cells and the results for the 4th,6th and 8th week are different(P＜0.05).The over training can cause the cardiac structure change and it is related with the over apoptosis of the myocardial cells.The paper proposes to establish the over training animal model on the basis of overload concept.

Key wordsover training;cardiac structure;apoptosis

First author’s addressHealth Science Dept.,Wuhan Sport Univ.,Wuhan 430079,China

在競爭日益激烈的競技體育運(yùn)動中,大負(fù)荷訓(xùn)練是必不可少的,但運(yùn)動訓(xùn)練并非刺激強(qiáng)度越大,訓(xùn)練效果越好。它是一門融合了多學(xué)科的科學(xué),其安排必須高度符合人體生理機(jī)能的變化規(guī)律。合理地安排運(yùn)動訓(xùn)練中的各個(gè)環(huán)節(jié)(負(fù)荷強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間、運(yùn)動量、恢復(fù)方式等),才能產(chǎn)生最大的運(yùn)動訓(xùn)練效果。超負(fù)荷訓(xùn)練是運(yùn)動訓(xùn)練中最常用的一種訓(xùn)練方法,運(yùn)動訓(xùn)練過程就是超負(fù)荷訓(xùn)練——超量恢復(fù)——超負(fù)荷訓(xùn)練——超量恢復(fù)這種周而復(fù)始的過程。研究認(rèn)為運(yùn)動訓(xùn)練中心臟肯定存在缺血、缺氧現(xiàn)象,但在其自我保護(hù)機(jī)制的作用下不會增加心肌細(xì)胞的凋亡［1,2］。而一旦運(yùn)動負(fù)荷超出了機(jī)體防御的能力與心臟的耐受性,可導(dǎo)致心肌細(xì)胞過度凋亡,造成心臟損傷。本研究擬觀察超負(fù)荷訓(xùn)練后心肌結(jié)構(gòu)的變化以及心肌細(xì)胞凋亡的程度,為下一步尋找預(yù)防超負(fù)荷訓(xùn)練后心肌細(xì)胞過度凋亡的方法打下基礎(chǔ)。

材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性Sprague-Dauley(SD)大鼠 20只,體重 300±30g,三月齡(合格證號 SCXK鄂2008-0004)。分籠飼養(yǎng),每籠5只,標(biāo)準(zhǔn)嚙類動物飼料喂養(yǎng),自由飲食。動物室溫度22℃～28℃,相對濕度50%～65%。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

TdT酶(Promega Corporation);TUNEL試劑盒、蛋白酶K消化液,辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈親合素、DAB顯色液、蘇木素染色液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司);中性樹膠(中國上海標(biāo)本模型廠);SKP-02.600電熱恒溫培養(yǎng)箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司),顯微鏡、攝像裝置及成像系統(tǒng)(廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 超負(fù)荷訓(xùn)練方法

根據(jù)超負(fù)荷概念建立超負(fù)荷訓(xùn)練動物模型,超負(fù)荷指的是運(yùn)動員對某一負(fù)荷刺激基本適應(yīng)后,必須適時(shí)、適量地增大負(fù)荷使之超過原有負(fù)荷,運(yùn)動能力才能繼續(xù)增長,這個(gè)超過原有負(fù)荷的負(fù)荷就是超負(fù)荷。訓(xùn)練方案同前文［3］。8周后處死動物觀測大鼠心臟變化,確定造模成功。正常未訓(xùn)練大鼠作為對照組。

1.3.2 組織學(xué)觀察

分別切取橫向和縱向心臟標(biāo)本,10%中性福爾馬林磷酸鹽緩沖液固定24h后,取出,自來水沖洗,梯度酒精脫水,石蠟包埋切片后蘇木素-伊紅染色(HE染色)。光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞和心肌纖維的變化。

1.3.3 透射電鏡觀察

大鼠處死后,迅速取左心室前壁心肌組織0.5～1mm3,沖凈血液,分別用3%戊二醛和1%鋨酸固定,酒精梯度脫水,環(huán)氧樹脂滲透、包埋,超薄切片,醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色后進(jìn)行電鏡觀察。

1.3.4 原位檢測心肌細(xì)胞凋亡

采用TUNEL法(TdT-mediated dUTP-Dig nick endlabeling)定量觀察凋亡細(xì)胞。操作步驟:切片常規(guī)脫蠟至水,經(jīng)3%雙氧水處理、蛋白酶 K消化后,加入轉(zhuǎn)移酶(TDT)和地高辛標(biāo)記的核苷酸(Dig-dUTP)4℃過夜,封閉后加生物素化抗地高辛抗體,洗滌,加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液(SABC),DAB顯色,光鏡下觀察。TUNEL陽性細(xì)胞的判斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核呈棕褐色或棕黃色,并且具備凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。隨機(jī)取10個(gè)高倍鏡視野,讀取凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù),計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,SAS6.12統(tǒng)計(jì)軟件處理。采用單因素方差分析(SNK法),定義 P＜0.05為顯著性界值。

結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察

大鼠心臟HE染色觀察可見對照組大鼠心肌纖維排列整齊勻稱,毛細(xì)血管微動靜脈形態(tài)正常;訓(xùn)練組大鼠心肌纖維腫脹,排列紊亂,部分?jǐn)嗔鸭熬衷顮顗乃?內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,小血管瘀血(如圖1)。

圖1 大鼠心臟 HE染色觀察(20×)(a:對照組;b:訓(xùn)練組)

2.2 透射電鏡觀察

結(jié)果顯示對照組心肌肌原纖維排列規(guī)則,肌小節(jié)寬度一致,M線、H線清晰;線粒體無明顯腫脹,嵴及基質(zhì)清晰,致密,嵴排列規(guī)則整齊;訓(xùn)練組心肌細(xì)胞腫脹,肌原纖維排列紊亂,部分?jǐn)嗔?甚至消失,橫紋不規(guī)則,肌節(jié)長短不一;線粒體大小不一,有空泡化表現(xiàn),嵴模糊不清,閏盤扭曲、擴(kuò)張,染色質(zhì)邊集;偶見細(xì)胞核溶解現(xiàn)象(如圖2)。

圖2 大鼠心肌透射電鏡下觀察(1300×)(a:對照組;b:訓(xùn)練組)

2.3 原位檢測心肌細(xì)胞凋亡

結(jié)果顯示訓(xùn)練組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯多于對照組,兩組之間凋亡指數(shù)比較存在顯著性差異(p＜0.05)。隨著訓(xùn)練時(shí)間延長心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)不斷增高,訓(xùn)練組三個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較均存在顯著性差異(p＜0.05)(如圖3,表1)。

圖3 圖3TUNEL法定量觀察凋亡細(xì)胞(40×)(a:對照組;b:訓(xùn)練4周;c:訓(xùn)練6周;d訓(xùn)練8周)

表1 兩組動物心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(%)

討論

運(yùn)動訓(xùn)練的本質(zhì)是人們期望通過一種有意識、有目的、按計(jì)劃實(shí)施的強(qiáng)烈刺激,引起機(jī)體相應(yīng)發(fā)生劇烈的應(yīng)答性變化,產(chǎn)生預(yù)期的變化。因此,在強(qiáng)烈的運(yùn)動刺激作用下,機(jī)體幾乎每一個(gè)系統(tǒng)與器官的機(jī)能狀態(tài)都會受到程度不等的影響。心臟作為對運(yùn)動強(qiáng)度最敏感的器官,對運(yùn)動能力的提高起著至關(guān)重要的作用。研究結(jié)果表明,長期系統(tǒng)的適宜運(yùn)動可使運(yùn)動員心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生適應(yīng)性變化——心室增厚、室內(nèi)徑增大、室間隔增厚每搏量和心肌重量加大,冠狀動脈變粗等,導(dǎo)致心肌血供增加、心臟泵血能力提高和身體氧代謝能力增強(qiáng)。

機(jī)體對運(yùn)動刺激的基本反應(yīng)大體分5個(gè)階段,耐受階段、疲勞階段、恢復(fù)階段、超量補(bǔ)償階段和消退階段。在系統(tǒng)的訓(xùn)練和恢復(fù)后機(jī)體呈現(xiàn)以心肌生理性肥大為特征的適應(yīng)性心臟結(jié)構(gòu)重塑和心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變,如心房特殊顆粒增多［4］,心肌細(xì)胞內(nèi)高爾基復(fù)合體增多、肌質(zhì)網(wǎng)粒、橫管系統(tǒng)發(fā)達(dá)、核糖體和糖原增多等,這些心肌超微結(jié)構(gòu)的改變是運(yùn)動心臟形成的基礎(chǔ)。而在缺乏充足的外源性超量補(bǔ)償和良好的疲勞恢復(fù)情況下,持續(xù)大強(qiáng)度超負(fù)荷訓(xùn)練則會造成心肌微損傷,如心肌纖維排列不齊甚至斷裂,肌節(jié)攣縮,Z線不規(guī)則增寬,細(xì)胞間質(zhì)減少,血液淤積,線粒體腫脹,細(xì)胞核腫脹、核皺縮、基質(zhì)變性,染色體邊聚,線粒體嵴斷裂,大小不等的空泡形成,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等心肌損傷的形態(tài)學(xué)改變［5,6］。本研究中我們觀察到超負(fù)荷訓(xùn)練大鼠心臟微觀結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)都出現(xiàn)了類似的變化,表明長期、過大的運(yùn)動強(qiáng)度刺激,可以使機(jī)體心肌結(jié)構(gòu)損害累積,最終引起心臟功能下降。

目前,心肌細(xì)胞凋亡的研究多數(shù)為臨床研究,集中在臨床疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究上,但與運(yùn)動訓(xùn)練引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡有所區(qū)別。近年來,國內(nèi)外對運(yùn)動訓(xùn)練與心肌細(xì)胞調(diào)亡之間的關(guān)系也進(jìn)行了一些研究,并形成了一致的觀點(diǎn):運(yùn)動強(qiáng)度達(dá)到一定的閾值后,無論是適宜的運(yùn)動刺激心竭還是達(dá)到力竭程度,運(yùn)動過程中心臟都會存在一定程度的缺血、缺氧現(xiàn)象［7-9］,這種缺血、缺氧現(xiàn)象必然會引起心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。然而由于心臟自身防御系統(tǒng)的存在［10］,兩種運(yùn)動強(qiáng)度引起心肌細(xì)胞凋亡后的結(jié)果卻迥然不同:一段時(shí)間的適宜運(yùn)動強(qiáng)度刺激后心肌細(xì)胞會發(fā)生適應(yīng)性重塑,當(dāng)再次受到較強(qiáng)刺激,心肌細(xì)胞耐受缺血、缺氧能力會較前明顯增強(qiáng),雖然受損的心肌細(xì)胞也會發(fā)生凋亡,但它只是受損細(xì)胞的自我清除以及心肌結(jié)構(gòu)與功能的自我恢復(fù),呈現(xiàn)為生理性反應(yīng)過程;而一段時(shí)間的反復(fù)大強(qiáng)度運(yùn)動可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡比率明顯增加,當(dāng)?shù)蛲龅募?xì)胞無法有效清除后,細(xì)胞受損累積,心臟會由生理性改變向病理性改變發(fā)展,最終引起心臟損害,這也可能是過度訓(xùn)練導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷的病理機(jī)制之一。金其貫、常蕓、張鈞等［7-9,11］學(xué)者的研究都表明,力竭運(yùn)動和超負(fù)荷運(yùn)動時(shí),大鼠心肌細(xì)胞凋亡顯著增加,且隨著強(qiáng)度的加大,凋亡細(xì)胞的數(shù)目上升,說明心肌細(xì)胞凋亡可能參與了心臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的丟失,與運(yùn)動損傷有關(guān),并且心肌細(xì)胞凋亡可能是心臟由生理性向病理性轉(zhuǎn)變的誘因之一。

與眾多學(xué)者研究結(jié)果一致,我們也觀察到超負(fù)荷訓(xùn)練會引起心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增高,表明我們所制作的動物模型達(dá)到超負(fù)荷訓(xùn)練標(biāo)準(zhǔn),為進(jìn)一步研究超負(fù)荷訓(xùn)練對機(jī)體的影響打下良好的基礎(chǔ),并最終為運(yùn)用中醫(yī)藥手段減輕超負(fù)荷訓(xùn)練對機(jī)體的影響提供了可靠的訓(xùn)練方式。

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(2010-9-16收稿)

Experimental study of cardiac structure change caused by the over training and over apoptosis of myocardial cells

LIU Hua,HE Lei-lei,YANG Yi

G804.22

A

1672-268X(2010)02-046-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30700388);湖北省教育廳科研計(jì)劃項(xiàng)目(Q20083303)。