馬建榮，余永紅，張景海

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實驗實訓(xùn)中心，廣東廣州510520;2.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧沈陽110016)

抗癌鎮(zhèn)痛肽AGAP肺靶向融合體在畢赤酵母中的表達

馬建榮1，余永紅1，張景海2*

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實驗實訓(xùn)中心，廣東廣州510520;2.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧沈陽110016)

利用構(gòu)建好的質(zhì)粒pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP(analgesic-antitumor peptide，抗癌鎮(zhèn)痛肽)進行單酶切線性化，然后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，電轉(zhuǎn)之后的菌落通過菌落PCR進行篩選，最終得到陽性菌落。陽性菌落經(jīng)增菌培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)后的上清SDS-PAGE電泳后經(jīng)western blot檢測證明，抗癌鎮(zhèn)痛肽肺靶向融合體已經(jīng)成功得到表達。

東亞鉗蝎;抗癌鎮(zhèn)痛肽;畢赤酵母;真核表達

蝎毒種類多，相對分子量小、穩(wěn)定性好、活性強，具有廣泛的生物學(xué)作用［1］。蝎毒蛋白一般是由20～80個氨基酸組成的多肽。AGAP是劉巖峰、張景海［2］于2003年由蝎毒中提取的具有抗腫瘤和鎮(zhèn)痛活性的活性多肽，并且已經(jīng)實現(xiàn)了在大腸埃希菌中的表達。但是在其表達中仍存在一些問題，例如分離純化過程復(fù)雜，需要去除內(nèi)毒素，活性受到一定影響等。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)基因表達系統(tǒng)經(jīng)過近十年發(fā)展，已基本成為較完善的外源基因表達系統(tǒng)，且具有易于高密度發(fā)酵，表達基因穩(wěn)定整合在宿主基因組中，能使產(chǎn)物有效分泌并適當(dāng)糖基化，培養(yǎng)方便經(jīng)濟等特點。利用強效可調(diào)控啟動子AOX1，用該系統(tǒng)成功表達的外源基因有30多種，其中大部分為醫(yī)藥制品，如人白介素-2、人血清白蛋白、腫瘤壞死因子、乙肝表面抗原、人巨細胞病毒(cytomegalovirus)抗原、抗凝血因子水蛭素衍生物(hirudin variants)、血管緊張肽-Ⅰ轉(zhuǎn)換酶等，有些即將進入市場［3-4］，證實該系統(tǒng)為高效、實用、簡便，以提高表達量并保持產(chǎn)物生物學(xué)活性為突出特征的外源基因表達系統(tǒng)，而且非常適宜擴大為工業(yè)規(guī)模。與大腸埃希菌的表達相比，畢赤酵母具有利于蝎毒蛋白正確折疊、分離純化簡單方便等優(yōu)點。因此本研究擬實現(xiàn)抗癌鎮(zhèn)痛肽AGAP 肺靶向融合體在畢赤酵母中的表達。

1 材料與方法

1.1 材料

pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP、大腸埃希菌BL-21，沈陽藥科大學(xué)構(gòu)建保藏;畢赤酵母GS115，invitrogen公司;各種限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、Taq酶及PCR反應(yīng)緩沖液，TaKaRa(Japan)公司; Western Blot中使用的抗體(兔抗)，本實驗室制備保存;堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)-Alkaline Phosphatase Goat Anti-Rabbit IgG(H+ L)，北京中杉生物公司;顯色液BCIP/NBT(0.48 mmol/L和0.51 mmol/L)，Amresco產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 載體pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP線性化線性化的質(zhì)粒與酵母基因組更容易發(fā)生重組整合，因此載體pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP首先進行SacⅠ單酶切，成為帶有2個粘性末端的線性分子，以便轉(zhuǎn)入畢赤酵母后與基因組同源重組。

1.2.2 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化步驟參考MicroPulserTM Electroporation Aparatus Operating Instructions and Applications Guide(MicroPulser TM電穿孔儀操作說明和應(yīng)用指導(dǎo)，BIO-RAD)。

1.2.3 克隆篩選菌落PCR:用牙簽挑取轉(zhuǎn)化平板上長出的單菌落，涂抹到200 μL離心管底，微波1 min;－80℃凍5 min，再微波1 min。加入20 μL無菌水溶解，離心后取1～2 μL上清做模板，配制50 μL PCR體系。

1.2.4 表達產(chǎn)物的Western Blot檢測挑取克隆篩選得到的陽性菌落于25 mL BMGY(Buffered glycerol complex medium)培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)至OD600≈4.1。離心、收集菌體，用100 mL BMMY (Buffered methanol complex medium)培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)。每日取樣1 mL，并補加純甲醇于培養(yǎng)基至終濃度為1%，誘導(dǎo)表達6 d，取樣品加入2×SDS上樣緩沖液在100℃沸水中變性處理3～5 min，離心去沉淀后，用于Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%分離膠80 V，5%積層膠120 V)。SDS-PAGE分離后，用電泳轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)移至預(yù)處理的PVDF膜上，恒壓94 V，轉(zhuǎn)移30 min。取出PVDF，用蒸餾水漂洗5 min，將膜置于封閉緩沖液(TBST+5%BSA)中，室溫輕搖2.5 h，取出，用TBST漂洗3次，每次5 min。1∶100加入一抗，4℃過夜反應(yīng)。取出，用TBST漂洗3次，每次5 min。1∶1000加入二抗(堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG)，室溫輕搖2 h。取出，用TBST漂洗3次，每次5 min。加入顯色液BCIP/NBT，不斷搖動，直到顯出顏色條帶，用蒸餾水漂洗中止染色［5］。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP線性化

如圖1所示，右側(cè)泳道樣品為表達載體pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP，由于正/負超螺旋和線型分子的泳動速度不同而呈現(xiàn)多條譜帶，中間泳道為表達載體pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP雙酶切后解除正/負超螺旋結(jié)構(gòu)，成線性，所以只有一條譜帶出現(xiàn)。

圖1 質(zhì)粒pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP線性化結(jié)果Fig.1Enzyme digestion of pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP Electrophoresis type is 1.0%agarose gel;Lane 1 is marker λDNA Hind III;Lane 2 is pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP digested by Sac I;Lane 3 is undigested pPIC9K-RGD-4CHis Tag-AGAP電泳采用1.0%的瓊脂糖凝膠，1:分子量標(biāo)準λDNA Hind III;2:經(jīng)Sac I消化后的質(zhì)粒RGD-4C-His Tag-AGAP;3:未經(jīng)消化的RGD-4C-His Tag-AGAP

2.2 克隆篩選

分別以菌落處理后的上清、pPIC9K轉(zhuǎn)化的畢赤酵母處理后的上清和質(zhì)粒pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP為模板進行PCR，作為陰性和陽性對照。電泳觀察結(jié)果。如圖2所示:A、B、C、D 4個菌株與陽性對照相同位置均有條帶，為陽性轉(zhuǎn)化子。

2.3 表達產(chǎn)物的western blot檢測

以菌液誘導(dǎo)后上清為樣品，以pPIC9K轉(zhuǎn)化的菌液誘導(dǎo)后上清為陰性對照，以原核表達的RGD-4C-His Tag-AGAP蛋白作為陽性，進行SDSPAGE電泳，9 V轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜30 min，BICP/ NBT顯色觀察實驗結(jié)果。如圖3所示，樣品在與陽性對照相同位置有條帶，證明RGD-4C-His Tag-AGAP在畢赤酵母中得到成功表達。

3 討論

酵母作為單細胞真核生物，易于培養(yǎng)，生長繁殖速度快，具有比大腸埃希菌更加完備的基因表達調(diào)控機制、基因表達產(chǎn)物正確折疊的細胞內(nèi)環(huán)境以及對產(chǎn)物的加工修飾及分泌能力。尤其是釀酒酵母，其基因測序已經(jīng)于1996年完成，而且安全性高，因此酵母作為基因工程表達系統(tǒng)得到廣泛的研究和應(yīng)用。

Shao等［6］在釀酒酵母中成功表達了來源于東亞鉗蝎的哺乳動物神經(jīng)毒素BmK M1，并且分泌到培養(yǎng)基中，表達水平達到5 mg/L發(fā)酵液。雖然跟天然BmK M1相比，重組BmK M1在N端有2個額外的氨基酸殘基，但是并沒有影響活性。相比之下，當(dāng)沒有額外的氨基酸存在時，表達極不穩(wěn)定。這種酵母表達蝎毒素基因工程產(chǎn)物時信號肽切除不完全的現(xiàn)象在Pang等［7］將化學(xué)合成的抗昆蟲毒素短肽BeI5A的基因轉(zhuǎn)入酵母菌中時就曾經(jīng)有過。實驗證明，當(dāng)細胞內(nèi)有大量外源蛋白質(zhì)合成時，酵母氨肽酶的活力不足以切除它們氨基末端多余的氨基酸殘基，酵母的自身平衡調(diào)節(jié)機制被破壞，就會出現(xiàn)信號肽切除不完全現(xiàn)象。

除了上述基因外，在釀酒酵母中表達的重組蝎毒素基因還有昆蟲特異性蝎神經(jīng)毒素AaH IT1［8］。但是只有很小的一部分重組蛋白被釋放到培養(yǎng)基中。這也是由于釀酒酵母的分泌效率不太高造成的。而且釀酒酵母缺乏強有力的啟動子，不適合高密度培養(yǎng)。

當(dāng)利用釀酒酵母制備時，實驗室的結(jié)果很令人鼓舞，但由實驗室擴展到工業(yè)規(guī)模時，其產(chǎn)量迅速下降。原因是培養(yǎng)基中維持質(zhì)粒高拷貝數(shù)的選擇壓力消失，質(zhì)粒變得不穩(wěn)定，拷貝數(shù)下降?？截悢?shù)是高效表達的必備因素，因此拷貝數(shù)下降，也直接導(dǎo)致外源基因表達量的下降。同時，實驗室用培養(yǎng)基成分復(fù)雜且昂貴，當(dāng)采用工業(yè)規(guī)模能夠接受的培養(yǎng)基時，導(dǎo)致了產(chǎn)量的下降。有鑒于此，人們發(fā)展了新一代的酵母表達系統(tǒng)—巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統(tǒng)，即甲醇酵母表達系統(tǒng)［9］。

甲基營養(yǎng)型酵母包括:Pichia、Candida等，以Pichia pastoris(巴斯德畢赤酵母)為宿主的外源基因表達系統(tǒng)近年來發(fā)展最為迅速，應(yīng)用也最為廣泛，已利用此系統(tǒng)表達了一系列有重要生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。畢赤酵母系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，原因在于該系統(tǒng)除了具有一般酵母所具有的特點外，還有以下幾個優(yōu)點［10-12］:具有目前最強，調(diào)控機理最嚴格的啟動子;表達質(zhì)粒能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合;菌株易于進行高密度發(fā)酵，外源蛋白表達量高;存在過氧化物酶體，表達的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對細胞的毒害作用。

Pichia pastoris酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒，所以表達載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，將外源基因表達框架整合于染色體中以實現(xiàn)外源基因的表達［13］，包括啟動子、外源基因克隆位點、終止序列、篩選標(biāo)記等。表達載體都是穿梭質(zhì)粒，先在大腸埃希菌復(fù)制擴增，然后被導(dǎo)入宿主酵母細胞。為使產(chǎn)物分泌至胞外，表達載體還需帶有信號肽序列。

畢赤酵母表達系統(tǒng)有多種分泌型表達質(zhì)粒，有許多蛋白在畢赤酵母得到了高效分泌表達［14-16］。胞外表達需要在外源蛋白的N末端添加一段信號肽序列，引導(dǎo)重組蛋白進入分泌途徑，可使蛋白質(zhì)在分泌到胞外之后獲得準確的構(gòu)型。本課題采用的就是畢赤酵母分泌性表達載體pPIC9K。成功實現(xiàn)了抗癌鎮(zhèn)痛肽肺靶向融合體在畢赤酵母中的分泌表達。目前國外尚無蝎毒在畢赤酵母中成功表達的報道，國內(nèi)僅有2篇文獻報道已成功表達蝎毒蛋白［17-18］，但尚無人報道成功表達AGAP。本研究的成功對以后蝎毒在畢赤酵母中表達研究具有重要意義。

［1］吳虹雨，張威.蝎毒對離子通道的作用及應(yīng)用［J］.沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2001，3(1):56-57.

［2］Liu YF，Ma RL，Wang SL，et al.Expression of an antitumor-analgesic peptide from the venom of Chinese scorpion Buthus martensii karsch in Escherichia coli［J］.Protein Expr Purif，2003，27(2):253-258.

［3］Cregg J M，Vedvick T S，Raschke W C.Recent Advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris［J］.Bio/Technology，1993，11(8):905-910.

［4］Hollenberg C P，Gellissen G.Production of recombinant proteins by methylotrophic yeasts［J］.Curr Opin Biotechnol，1997，8 (5):554-560.

［5］Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed［M］.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989:366-373.

［6］Shao F，Xiong Y-M，Zhu R-H，et al.Protein Expr［J］.Purif，1999，17(3):358.

［7］Pang S Z，Oberhaus S M，Rasmussen J L，et al.Expression of a gene encoding a scorpion insectotoxin peptide in yeast，bacteria and plants［J］.Gene，1992，116:165-166.

［8］Martin-Eauclaire M F，Sogaard M，Rasmussen J L，et al.Production of active，insect－specific scorpion neurotoxin in yeast［J］.European Journal JBiochem，1994，223(2):637.

［9］唐元家，余柏松.巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)［J］.國外醫(yī)藥抗生素分冊，2002，23(6):346.

［10］李晶，趙曉祥，沙長青，等.甲醇酵母基因表達系統(tǒng)的研究進展［J］.生物工程進展，1999，19(2):17-20.

［11］歐陽立明，張惠展，張嗣同.巴斯德畢赤酵母的基因表達系統(tǒng)研究進展［J］.生物化學(xué)與生物物理進展，2000，27(2): 151-154.

［12］彭毅，楊希才，康良儀.影響甲醇酵母外源蛋白表達的因素［J］.生物技術(shù)通報，2000，4:33-36.

［13］EasySelect Pichia Expression Kit，Catalog no.［M］K1740-01，Invitrogen.

［14］Adriaan van Kooij，a Jeena Middel，a Ferenc Jakab，et al.High level expression and secretion of truncated forms of herpes simplex virus type I and type II glycoprotein D by the methylotrophic yeast Pichia pastoris［J］.Protein Expression and Purification，2002，25:400-408.

［15］Michiro Muraki.Secretory expression of synthetic human Fas ligand extracellular domain gene in Pichia pastoris:Influences of tag addition and N-glycosylation site deletion，and development of a purification method［J］.Protein Expression and Purification，2006，50(2):137-146.

［16］Chen Z，Wang D，Cong Y，et al.Recombinant antimicrobial peptide hPAB-β expressed in Pichia pastoris，a potential agent active against methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2011，89(2):281-291.

［17］呂猛，王昆，曹志賤，等.東亞鉗蝎毒素BmαTX14的基因組克隆、真核表達純化及功能的初步研究［J］.生物工程學(xué)報，2005，21(6):853-857.

［18］Feng Shao，Yu-Mei Xiong，Rong-Huan Zhu，et al.Expression and Purification of the BmK M1 Neurotoxin from the Scorpion Buthus martensii Karsch［J］.Protein Expression and Purification，1999，17:358-365.

Expression of a Lung Targeted Fusion Protein AGAP in Pichia pastoris

MA Jian-rong1，YU Yong-hong1，ZHANG Jing-hai2
(1.Exp.Ctr.，Guangdong Food and Drug Vocat’l Coll.，Guangzhou 510520; 2.Sch.of Life Sci.＆Biopharm.，Shenyang Pharm.Uni.，Shenyang 110016)

A constructed plasmid pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP(analgesic-antitumor peptide)was linearized with single enzyme digestion and electroporation transformed into Pichia pastoris GS115，the transformed colonies were screened through colony PCR and finally obtained positive ones.And they were proliferated，and the supernatant SDSPAGE after induced with methanol and tested proved with western blot that fusion protein of lung targeted RGD-4C-His Tag-AGAP was expressed successfully.

East Asian pincers scorpion(Buthus martensii Karsch);AGAP;Pichia pastoris;eukaryotic expression

Q786

A

1005－7021(2011)01－0015－04

國家自然科學(xué)基金(30772738);沈陽市科技局沈陽市藥學(xué)生物技術(shù)重點實驗室建設(shè)基金(1081102-1-00)

馬建榮女，碩士。從事生物技術(shù)和生物信息學(xué)等方面研究。Tel:020-28854174，E-mail:ma_jianrong@yahoo.com.cn

*通訊作者。Tel:024-23986431，E-mail:Jinghaizhang2000@yahoo.com.cn

2010-10-26;

2011-01-20