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        甘蔗渣纖維素降解菌的篩選及鑒定

        2011-09-25 09:31:16賀軍軍羅萍陳永輝易潤(rùn)華李勤奮戴小紅
        微生物學(xué)雜志 2011年1期
        關(guān)鍵詞:甘蔗渣初篩濾紙

        賀軍軍,羅萍,陳永輝,易潤(rùn)華,李勤奮,戴小紅

        (1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站,廣東湛江524013;2.廣東海洋大學(xué),廣東湛江524088; 3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所,海南儋州571737)

        甘蔗渣纖維素降解菌的篩選及鑒定

        賀軍軍1,羅萍1,陳永輝1,易潤(rùn)華2,李勤奮3*,戴小紅1

        (1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站,廣東湛江524013;2.廣東海洋大學(xué),廣東湛江524088; 3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所,海南儋州571737)

        通過(guò)利用多種選擇性培養(yǎng)基,從自然發(fā)酵不同階段的甘蔗渣中分離到多種纖維素分解菌,經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩,獲得了降解纖維素的功能菌株c1g3-3及其最適功能培養(yǎng)基蛋白胨纖維素培養(yǎng)基(PCS),并通過(guò)形態(tài)、生理生化和分子綜合鑒定得出c1g3-3鑒定為木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)。

        甘蔗渣;纖維素;功能降解菌

        甘蔗是我國(guó)大宗的糖料經(jīng)濟(jì)作物,在我國(guó)熱區(qū)的經(jīng)濟(jì)中占有重要地位,是廣西和云南的主要產(chǎn)業(yè)。甘蔗渣是甘蔗榨糖后的主要副產(chǎn)品,屬于農(nóng)業(yè)固體廢棄物,主要組分:干物質(zhì)90%~92%,粗蛋白質(zhì)2.0%,粗纖維44%~46%,粗脂肪0.7%,無(wú)氮浸出物42%,粗灰分2%~3%[1],如果不加以處理或利用會(huì)造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。因此,甘蔗渣的利用一直受到重視[2-8]。近幾年,隨著生物有機(jī)肥的快速發(fā)展,甘蔗渣成為生物有機(jī)肥堆制原料而受到重視,并配置成有機(jī)肥在農(nóng)業(yè)上得到應(yīng)用[9]。然而,由于甘蔗渣中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量高(占90%以上),降解速度慢、堆肥時(shí)間長(zhǎng),造成嚴(yán)重環(huán)境污染,成為肥料化利用的制約因素和研究重點(diǎn)。本文從甘蔗渣資源化利用的角度出發(fā),通過(guò)對(duì)多種分離源的微生物進(jìn)行分離、純化和篩選,得到了快速降解甘蔗渣纖維素功能降解菌株,并對(duì)其生理特性及其培養(yǎng)條件進(jìn)行探討,以期為工廠化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 分離材料采集用于分離的甘蔗渣采自廣東省豐收糖業(yè)發(fā)展有限公司堆積場(chǎng)中。

        1.1.2 供試分離和篩選培養(yǎng)基①樣品分離采用4種培養(yǎng)基,具體如下:赫奇遜CMC培養(yǎng)基(C1):NaCl 0.1 g,KH2PO41 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,F(xiàn)eCl30.01 g,CaCl20.1 g,NaNO32.5 g,CMC 10 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L,pH 7.2~7.4;赫奇遜CMC-Na培養(yǎng)基(C2):NaCl 0.1 g,KH2PO41 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,F(xiàn)eCl30.01 g,CaCl20.1 g,NaNO32.5 g,CMC-Na 10 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L,pH 7.2~7.4;纖維素剛果紅平板培養(yǎng)基(C3): (NH4)2SO42 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO41 g,NaCl 0.5 g,CMC-Na 10 g,瓊脂20 g,剛果紅0.2 g,蒸餾水1 L,pH值自然;纖維素剛果紅平板培養(yǎng)基(C4):(NH4)2SO42 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO41 g,NaCl 0.5 g,CMC 10 g,瓊脂20 g,剛果紅0.2 g,蒸餾水1 L,pH值自然;②功能菌株篩選培養(yǎng)基,具體如下:Dubos纖維素培養(yǎng)基: NaNO30.5 g,K2HPO41 g,F(xiàn)e2(SO4)3·7H2O 0.001 g,CMC 5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KCl 0.5 g,蒸餾水1 L,pH 7.5;Hutchison培養(yǎng)基:NaNO32.5 g,NaCl 0.1 g,KH2PO41 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,F(xiàn)eCl30.01 g,CaCl20.1 g,CMC 5 g,蒸餾水1 L,pH 7.2~7.4;磷酸銨鈉培養(yǎng)基:Na(NH4)HPO42 g,CaCO35 g,KH2PO41 g,CaCl2·6H2O 0.3 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,蛋白胨1 g,蒸餾水1 L,纖維素5 g;蛋白胨纖維素培養(yǎng)基:NaCl 5 g,CaCO32 g,K2HPO40.5 g,MgSO40.5 g,剛果紅0.1 g,蛋白胨5 g、酵母膏5 g,纖維素5 g,微量元素溶液0.5 mL(微量元素液成分(g/L):ZnSO40.30,CaCl20.25,CuSO40.25,F(xiàn)eSO40.20),蒸餾水1 L,50℃靜置培養(yǎng);改良纖維素剛果紅培養(yǎng)基(g/L):NaCl 0.5,(NH4)2SO42,MgSO4·7H2O 0.5,KH2PO41,纖維素粉5,蛋白胨1,蒸餾水1 L,pH值自然; CMC培養(yǎng)基:(NH4)2SO44 g,KH2PO42 g,CMCNa 5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,蛋白胨1 g,蒸餾水1 L,pH 7.0~7.4。

        1.2 方法

        1.2.1 纖維素降解菌的分離采用平板稀釋法進(jìn)行分離。稱(chēng)取甘蔗渣樣品1.00 g,加入無(wú)菌水10 mL,在振蕩機(jī)上振蕩10 min,形成懸液,吸取1 mL懸液依10倍法稀釋到10-6,取10-6稀釋液0.1 mL涂布于分離培養(yǎng)基中,每處理重復(fù)3次,28℃培養(yǎng)72~96 h,計(jì)算菌落數(shù)。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等挑取單菌落,按常規(guī)方法純化后保存。

        1.2.2 纖維素功能降解菌的篩選菌株初篩采用濾紙分解法,將濾紙剪成小條,放入試管中,使其略露出液面。將各菌株接種到以濾紙為唯一碳源的Dubos液體培養(yǎng)基中,然后于30℃、110 r/ min振蕩培養(yǎng)5 d,觀察濾紙的崩解效果;在初篩的基礎(chǔ)上,以FPA酶(3.5-乙硝基水楊酸比色法測(cè)定)為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)一步篩選得出纖維素功能降解菌株。

        1.2.3 培養(yǎng)基篩選將篩選得到的功能菌株分別接種到菌株篩選培養(yǎng)基中,進(jìn)行功能培養(yǎng)基的篩選,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

        1.2.4 菌株鑒定對(duì)篩選出的纖維素降解菌進(jìn)行種的鑒定:①形態(tài)學(xué)特征鑒定:將篩選出的纖維素降解菌接種于PDA平板中,28℃恒溫培養(yǎng)2~3 d,觀察其菌落的生長(zhǎng)情況、外觀形態(tài);②生理生化特征:主要包括過(guò)氧化氫酶、苯丙氨酸脫氨酶、卵磷脂酶試驗(yàn),糖、醇類(lèi)分解試驗(yàn),V-P測(cè)定,明膠液化,淀粉水解,丙二酸利用,吲哚產(chǎn)生及生長(zhǎng)pH值和溫度的測(cè)定等,方法參考東秀珠《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10];③分子鑒定:細(xì)菌的16S rRNA分析:經(jīng)改良的SDS法提取菌株降解微生物的基因組DNA。PCR引物為細(xì)菌鑒定通用引物:16(+)5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3,16(-)5-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT-3。25 μL擴(kuò)增體系:模板2 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,10×buffer 2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L) 2.5 μL,DNTP(2 mmol/L)2.5 μL,Taq(3 U/μL) 0.35 μL,ddH2O 13.15 μL。

        將提取的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性4 min,94℃變性1 min,50℃復(fù)性30 s,72℃延伸30 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)條件下檢測(cè),回收目標(biāo)DNA片段,由生工生物工程(上海)有限公司完成測(cè)序,測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件在GenBank進(jìn)行同源性比較,以Clustal X進(jìn)行多序列比對(duì)后,用MEGA4.0的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),并進(jìn)行1000次Bootstraps檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 功能菌株分離

        由表1可見(jiàn),培養(yǎng)基C1最適合分離纖維素降解菌,在樣品稀釋到10-6時(shí),每個(gè)平板可以得到菌落數(shù)5.20 cfu/g;其次是C3和C2分離效果較好,分離菌落數(shù)分別為3.20和2.80 cfu/g;而C4的分離效果較差。

        表1 不同培養(yǎng)基纖維素降解菌株分離效果(單位:cfu/g)Table 1Effect of cellulose degradation strains in different mediums(Unit:cfu/g)

        2.2 功能菌株初篩

        采用濾紙分解法對(duì)纖維素降解菌進(jìn)行初篩,由表2可見(jiàn),從甘蔗渣中共分離出27個(gè)菌株,其中降解能力強(qiáng)的有5個(gè)菌株,中度降解能力的有5個(gè)菌株,輕微降解能力的有13個(gè)菌株及沒(méi)有任何降解能力的4個(gè)菌株。

        表2 纖維素降解功能菌株初篩Table 2First screening of cellulose degrading-bacteria

        2.3 功能菌株復(fù)篩

        濾紙中的纖維素含量較高,F(xiàn)PA酶水解濾紙中的纖維素,釋放出的還原糖與3,5-乙硝基水楊酸(DNS)反應(yīng),產(chǎn)生顏色變化,這種顏色變化與釋放的還原糖量成正比關(guān)系,即與酶樣品的酶活性成正比關(guān)系。通過(guò)對(duì)FPA酶活性來(lái)評(píng)價(jià)初篩菌株對(duì)纖維素降解能力的大小,從而確定纖維素降解高效菌株。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明:c1g3-3菌株的FPA酶活性最好,為4.83 μg/(mL·h),被確定為纖維素功能降解菌株(表3)。

        表3 纖維素降解功能菌株復(fù)篩(單位:μg/(mL·h))Table 3Second screening of cellulose degrading-bacteria (Unit:μg/(mL·h))

        2.4 功能培養(yǎng)基篩選

        利用功能菌株在不同培養(yǎng)基上的FPA酶活性來(lái)評(píng)價(jià)菌株功能發(fā)揮的最適培養(yǎng)基。由表4可知:c1g3-3 FPA酶活性在6種不同培養(yǎng)基表現(xiàn)不一,在蛋白胨纖維素培養(yǎng)基(PCS)上活性最高為54.85 μg/(mL·h)。因此,c1g3-3菌株最適功能培養(yǎng)基為蛋白胨纖維素培養(yǎng)基(PCS)。

        表4 功能菌株在不同培養(yǎng)基上FPA酶活(單位:μg/(mL·h))Table 4FPA enzyme activity of degrading-bacteria in different mediums(Unit:μg/(mLl·h))

        2.5 高效菌株鑒定

        2.5.1 表面形態(tài)特征及生理生化指標(biāo)c1g3-3菌株菌落顏色黃白色,表面濕潤(rùn)、光滑,邊緣不整齊;桿菌,革蘭染色顯陰性,周生鞭毛,輕微彎曲的桿狀,大小為0.55 μm×1.58 μm,菌株生理生化測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

        表5 c1g3-3菌株的生理生化特征Table 5Physiological and biochemical characteristics of c1g3-3 strain

        續(xù)表

        2.5.2 分子鑒定c1g3-316S rDNA堿基長(zhǎng)度為1.5 bp左右,將菌株的16S rDNA全序列輸入GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)與無(wú)色桿菌屬(Achromobacter xylosoxidans)之間的同源性達(dá)到99%。選取近緣的菌株序列通過(guò)N-J算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1),將其初步定為木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)。

        圖1 c1g3-3菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1Phytogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of c1g3-3 strain

        3 小結(jié)與討論

        本文以甘蔗渣堆肥所需菌劑的開(kāi)發(fā)為主,通過(guò)對(duì)多種分離源的纖維素降解菌進(jìn)行分離、純化和篩選,從甘蔗渣中獲得了2株纖維素降解功能菌,并對(duì)其進(jìn)行了最佳培養(yǎng)基的篩選與鑒定。通過(guò)試驗(yàn)得出以下結(jié)論:①利用多種選擇培養(yǎng)基,經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩,從自然發(fā)酵不同階段的甘蔗渣中獲得了纖維素功能降解菌株c1g3-3;②c1g3-3菌株最適功能培養(yǎng)基為蛋白胨纖維素培養(yǎng)基(PCS);③通過(guò)形態(tài)、生理生化和分子綜合鑒定得出c1g3-3鑒定為木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)。

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        Screening and Identification of Cellulose Degrading-Bacteria from Fermented Bagasse

        HE Jun-jun1,LUO Ping1,CHEN Yong-hui1,YI Run-hua2,LI Qin-fen3,DAI Xiao-hong1
        (1.Zhanjiang Res.Sta.,CATAS,Zhanjiang 524013;2.Guangdong Ocean Uni.,Zhanjiang 524088; 3.Inst.of Envir.&Plant Prot.,CATAS,Danzhou Hainan,571737)

        Several cellulose degrading-bacteria were isolated form naturally fermented bagasse at different stages using multiple selective media.Strain c1g3-3,which had the capability of degrading cellulose of bagasse,was obtained through preliminary and secondary screenings,as well as the optimal PCS medium.Strain c1g3-3 was identified as Achromobacter xylosoxidans according to its morphology,physiology,bio-chemical and molecular characteristics.

        bagasse;cellulose;functional degrading-bacteria

        Q939.97

        A

        1005-7021(2011)01-0039-04

        中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)(2008hzslJ021,2009hzs1J033)

        賀軍軍男,研究實(shí)習(xí)員。研究方向?yàn)橘Y源開(kāi)發(fā)與利用。Tel:0759-2192696,E-mail:hbj46@163.com

        *通訊作者。Tel:0759-2192696,E-mail:qinfenli@sina.com

        2010-12-15;

        2011-01-25

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