陳瑜 楊立 潘泓 劉德森 茅乃權(quán) 黃耀元

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，廣西 南寧530021

肺癌已經(jīng)成為全球癌癥患者的首要死因，非小細(xì)胞肺癌 (non-small cell lung cancers，NSCLC)占肺癌的85%，其中主要為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌。Chen等［1］關(guān)于中國(guó)肺癌流行病學(xué)趨勢(shì)的研究結(jié)果顯示，2005年我國(guó)新增肺癌病例和死亡病例分別為536 407和475 768例，男性多于女性；1988年—2005年期間年均增長(zhǎng)1.6%。盡管肺癌的5年生存率從上個(gè)世紀(jì)60年代早期的8%提高到了90年代早期的15%，但仍有相當(dāng)大的上升空間。目前，早期NSCLC患者完全切除術(shù)后是否需要進(jìn)行常規(guī)輔助化療仍存在較大的爭(zhēng)議。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到腫瘤組織細(xì)胞表達(dá)的改變、結(jié)構(gòu)的改變以及蛋白功能的改變是影響其生物學(xué)活性的最根本因素。由于NSCLC進(jìn)行輔助化療能否獲益是由其分子機(jī)制決定的，所以如果有生物標(biāo)記作為標(biāo)準(zhǔn)來幫助篩選患者進(jìn)行治療，不僅能提高療效，還可避免不必要的藥物不良反應(yīng)。潘泓等［2］從30種化療相關(guān)蛋白中篩選出ERCC1、survivin、bax、VEGF 4個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)其聯(lián)合檢測(cè)對(duì)早期NSCLC術(shù)后化療療效的預(yù)測(cè)特異度達(dá)96.5%。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)ERCC1、survivin、bax、VEGF基因在早期NSCLC中的表達(dá)及其對(duì)術(shù)后化療療效的價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

2004年12月—2009年9月在我院住院并采用肺葉切除+淋巴結(jié)清掃手術(shù)治療的87例肺癌患者，年齡35～77歲，均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為NSCLC。其中鱗癌42例，腺癌26例，腺鱗癌18例，其他癌1例。臨床分期采用國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)(IASLC)2009年第七版分期標(biāo)準(zhǔn)(IASLC 2009)，Ⅰ期23例，Ⅱ期64例。所有患者均為首次發(fā)現(xiàn)肺癌，術(shù)前未行任何化療和放療。患者于術(shù)后3～4周開始使用以鉑類為主的化療方案，共化療3～4個(gè)周期，療程結(jié)束后，定期隨防。根據(jù)生存期將87例患者分為2組，存活3年或長(zhǎng)于3年者為預(yù)后好組(n=41)，中位生存期為46個(gè)月；存活短于3年者為預(yù)后差組(n=46)，中位生存期為27個(gè)月。

1.2 材料

TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(美國(guó)Promega公司)；PCR試劑(Genstar公司)；膠回收試劑盒(杭州BioFlux公司)；SYBR Green I 染料(中國(guó)Generay公司)。根據(jù)GenBank所發(fā)布的ERCC1、bax、survivin、VEGF、GAPDH基因序列，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物序列，并經(jīng)GenBank Blast檢索無顯著同源性。PCR引物合成(上海生物工程技術(shù)有限公司)，選用GAPDH作為內(nèi)參。多通道PCR儀(美國(guó)MJPT-220)；紫外分光光度計(jì)(日本島津SHIMADIU UV-1700)；凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司GelDoc2000型)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

NCBI搜索目的基因的序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)基因的引物。ERCC1上游引物：5’-CCCTGGGAATTTGGCGACGTAA -3’，下游引物：5’-CTCCAGGTACCGCCCAGCTTCC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度：223 bp；survivin上游引物：5’-GCCAGATTTGAATCGCGGGA-3’，下游引物：5’-GCAGTGGATGAAGCCAGCCT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度：1 8 5 b p；b a x上游引物：5’-CCTTTTGCTTCAGGGTTTCAT-3’，下游引物：5’-AGTCTGTGTCCACGGCG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度：188 bp；VEGF上游引物：5’-AAGATCCGCAGACGTGTAAATGTT-3’，下游引物：5’- CGGCTTGTCACATCTGCAAG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度：100 bp；GAPDH上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’，下游引物：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度：225 bp。

1.3.2 組織RNA的提取與鑒定

分別取液氮凍存的肺癌組織，加TRIzol后按試劑說明書操作步驟進(jìn)行 RNA提取，測(cè)定D260nm，計(jì)算RNA濃度。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

取2 μL RNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系：組織RNA 2 μL，OligoDT18 (0.5 μg/μL)1 μL，dNTP (10 mmol/L) 1 μL，MMLV(1 ×107U/L) 0.5 μL，RNA enzyme inhibitor 0.5 μL，DEPC水13 μL，總體積為22 μL，反應(yīng)條件為37 ℃ 1 h，然后95 ℃ 3 min。

1.3.4 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備

取經(jīng)檢驗(yàn)后可表達(dá)ERCC1、bax、Sur vivin、VEGF和GAPDH基因的模版，用普通PCR反應(yīng)進(jìn)行大量擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物，連接到E-ZT載體上。同樣方法制作GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.5 SYBR Green Ⅰ熒光實(shí)時(shí)定量PCR 測(cè)定

根據(jù)D值確定濃度，將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋為6個(gè)梯度(109、108、107、106、105和104)，作為模板進(jìn)行Real-time PCR并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。20 μL反應(yīng)體系包括：10×PCR buffer 2 μL，上游引物為(10 μmol/L) 0.4 μL，下游引物為(10 μmol/L) 0.4 μL，dNTPs (2.5 mmol/L)0.8 μL，SYBR Green Ⅰ 0.5 μL，Taq酶0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 14.7 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；59 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，讀板1次，升溫到90 ℃ 0.02 s，讀板1次，共40個(gè)循環(huán)。最后是72 ℃ 10 min延伸。56～100 ℃，每隔0.4 ℃讀板1次，獲得熔解曲線。

1.4 數(shù)據(jù)整理

目的基因與內(nèi)參基因同時(shí)在熒光定量PCR儀上反應(yīng)。每個(gè)基因設(shè)立空白對(duì)照(不含模板的反應(yīng)體系)、標(biāo)準(zhǔn)品、樣本同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)平行管，擴(kuò)增反應(yīng)至少重復(fù)2次。PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，儀器自行進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，給出各個(gè)樣品的Ct值(達(dá)到樣品熒光閾值的循環(huán)數(shù))與SQ值(Starting Quantity起始模板數(shù))。Ct值與SQ值的對(duì)數(shù)值之間存在著線性關(guān)系，以質(zhì)粒的拷貝數(shù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，可得標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)各個(gè)樣品的Ct值，讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的起始拷貝數(shù)，以此對(duì)每個(gè)樣品cDNA進(jìn)行定量分析。定量結(jié)果以SQ值表示。為了消除每個(gè)樣品反應(yīng)時(shí)cDNA量的不同，根據(jù)公式F=目的基因平均SQ值/GAPDH基因平均SQ值來進(jìn)行校正，得到樣本各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理?；颊吣挲g、性別、組織學(xué)類型、TNM分期和ERCC1、survivin、bax、VEGF表達(dá)采用COX模型進(jìn)行多因素回歸分析；ERCC1、survivin、bax和VEGF基因的mRNA在肺癌組織中表達(dá)相關(guān)性采用相關(guān)分析(秩相關(guān))，預(yù)后好組和預(yù)后差組兩組樣本各個(gè)基因拷貝數(shù)的比較采用秩和檢驗(yàn)，4種基因在不同病理類型和分期中表達(dá)的比較采用秩和檢驗(yàn)，生存分析的比較用Kaplan-Meier生存曲線和log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

重組基因質(zhì)粒經(jīng)PCR和測(cè)序核實(shí)，VEGF有1個(gè)堿基突變，為無意突變，重組基因質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 陽性標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過ERCC1、survivin、bax、VEGF、GAPDH質(zhì)粒初始拷貝數(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)的Ct值建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)＞0.995，可以作為檢測(cè)本組基因的良好標(biāo)準(zhǔn)品。

2.3 實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增熔解曲線

熒光定量PCR的熔解曲線顯示，采用熒光染料進(jìn)行各濃度質(zhì)粒ERCC1、survivin、bax、VEGF、GAPDH基因?qū)崟r(shí)熒光定量檢測(cè)，均出現(xiàn)單一的熔解峰，結(jié)果特異性好。

2.4 兩組患者臨床病理資料的對(duì)比分析

兩組患者的病理類型、臨床分期和化療方案的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而兩組患者的生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.5 COX多因素回歸分析結(jié)果

COX模型多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，患者年齡、性別、組織學(xué)類型、TNM分期和ERCC1、survivin、bax、VEGF表達(dá)均不是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素，并且ERCC1、survivin、bax、VEGF的表達(dá)量之間沒有明顯相關(guān)性。

表l 兩組患者臨床病理資料的對(duì)比分析Tab.1 Comparative analysis of clinical and pathological data of two groups of patients

2.6 ERCC1、survivin、bax、VEGF的表達(dá)量在預(yù)后好組和預(yù)后差組的比較

表達(dá)量的比較：ERCC1在兩組比較中，腺癌、鱗癌預(yù)后好組與預(yù)后差組的比較其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010；P=0.021)，腺鱗癌其兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.061)；Ⅰ期其兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033)，Ⅱ期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.051)。survivin在兩組比較中，腺癌、鱗癌其兩組的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012；P=0.023)，腺鱗癌其兩組的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.135)；Ⅰ期和Ⅱ期其兩組的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041；P=0.037)。bax在兩組比較中，腺癌、腺鱗癌其兩組比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009；P=0.032)，而鱗癌其兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.54)；Ⅰ期和Ⅱ期其兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034；P=0.012)。VEGF在兩組比較中，腺癌、鱗癌和腺鱗癌3組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009；P=0.016；P=0.003)；Ⅰ期和Ⅱ期其兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013，P=0.008)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERCC1、survivin、bax、VEGF在總的預(yù)后好組和預(yù)后差組各病理分型與分期表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

2.7 ERCC1、survivin、bax、VEGF的表達(dá)與生存期的關(guān)系

在87例肺癌組織中，將ERCC1、survivin、bax、VEGF的表達(dá)量分高、低表達(dá)者。ERCC1以中位數(shù)8.56為界，≤8.56為低表達(dá)者，＞8.56為高表達(dá)者，高表達(dá)者的中位生存期為41個(gè)月，低表達(dá)者的中位生存期為38個(gè)月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037，圖1A)；survivin以中位數(shù)6.26為界，≤6.26為低表達(dá)者，>6.26為高表達(dá)者，高表達(dá)者的中位生存期為37個(gè)月，低表達(dá)者中位生存期為45個(gè)月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.138，圖1B)；bax以中位數(shù)5.07為界，≤5.07為低表達(dá)者，>5.07為高表達(dá)者，高表達(dá)者的中位生存期為45個(gè)月，低表達(dá)者的中位生存期為39個(gè)月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.562，圖1C)；VEGF以中位數(shù)4.05為界，≤4.05為低表達(dá)者，>4.05為高表達(dá)者，高、低表達(dá)者的中位生存期為41個(gè)月，低表達(dá)者的中位生存期為40個(gè)月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.114，圖1D)。將符合ERCCl和survivin低表達(dá)、bax和VEGF高表達(dá)的15例與ERCCl和survivin高表達(dá)、bax和VEGF低表達(dá)的10例作生存分析，符合ERCCl和survivin低表達(dá)、bax和VEGF高表達(dá)的15例中位生存期為48個(gè)月，而ERCCl和survivin高表達(dá)、bax和VEGF低表達(dá)的10例中位生存期為18個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029，圖1E)。

表2 ERCC1、survivin、bax、VEGF的表達(dá)量在預(yù)后好組和預(yù)后差組的比較Tab.2 The comparison of the expression of ERCC1, survivin, bax and VEGF between the good prognosis group and the relatively poor prognosis group

圖1 不統(tǒng)基因表達(dá)情況下的患者生存分析Fig.1 Survival curves of patients with different genes expression

3 討 論

腫瘤分期是預(yù)測(cè)NSCLC患者生存率最有力的指標(biāo)，這一點(diǎn)已廣為認(rèn)同。如能將判斷預(yù)后的分子標(biāo)志作為選擇治療方法的標(biāo)準(zhǔn)，既可以提高療效，又能使不能受益的患者積極采取其他干預(yù)措施避免不必要的化療引起的不良反應(yīng)。張楠等［3］的研究表明，與腫瘤化療相關(guān)的基因有：藥物動(dòng)力學(xué)相關(guān)基因、各種生物酶相關(guān)基因、DNA損傷與修復(fù)相關(guān)基因、凋亡相關(guān)基因、致癌和抑癌基因、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等。目前有不少前瞻性的研究正在評(píng)估這些頗具希望的預(yù)后標(biāo)志物未來的應(yīng)用價(jià)值，但尚未找到可指導(dǎo)臨床治療的標(biāo)志物。NSCLC術(shù)后化療效果不佳是多因素、多基因參與的復(fù)雜過程，各個(gè)機(jī)制間存在相互交叉、相互依賴的關(guān)系，制定一個(gè)有效的、指導(dǎo)NSCLC術(shù)后化療的分子指標(biāo)需要進(jìn)行多因素分析，因此本研究選擇了一組基因進(jìn)行預(yù)測(cè)早期NSCLC術(shù)后化療療效，并指導(dǎo)臨床。

ERCC1基因是第一個(gè)克隆而得的人類DNA損傷修復(fù)基因[4]，定位于19號(hào)染色體上，屬于核切除修復(fù)基因家族，編碼一種蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)能與修復(fù)復(fù)合體的其他成員協(xié)同通過修復(fù)核苷酸的化學(xué)變化和結(jié)構(gòu)改變以確?；蚪M的完整性。ERCC1在維持組織修復(fù)功能中占有重要地位，有研究表明，肺癌中ERCC1高表達(dá)，往往導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)鉑類制劑耐藥從而導(dǎo)致化療療效差，影響生存率，這可能與ERCC1在修復(fù)損傷并維持基因組穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用有關(guān)［5-6］。Survivin又名生存素，是細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAPS)成員［7］。近來有研究表明，survivin是內(nèi)在腫瘤抑制網(wǎng)絡(luò)的通用靶位，survivin位點(diǎn)被認(rèn)為是抗腫瘤藥物的新型靶點(diǎn)［8］。bax是Bcl-2家族中的促凋亡成員，Bcl-2和bax通過阻斷凋亡信號(hào)通路中的最后共同通道而抑制細(xì)胞凋亡［9］。新的觀點(diǎn)認(rèn)為，對(duì)不同的腫瘤bax所起的作用可能不同；同一種腫瘤在不同的階段，bax所起的作用也可能不同。VEGF是一種分子質(zhì)量為46×103的高度糖基化的堿性蛋白，為血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)家族的一個(gè)成員，可由正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，VEGF可刺激血漿纖維蛋白等外滲并沉積在細(xì)胞外基質(zhì)，作為腫瘤基質(zhì)和毛細(xì)血管網(wǎng)形成的基礎(chǔ)［10］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ERCC1、survivin、bax、VEGF在預(yù)后好組和預(yù)后差組各病理分型和臨床分期中表達(dá)量的比較差異并非均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是87例早期NSCLC患者總的癌組織中ERCC1、survivin、bax、VEGF這一組基因的表達(dá)量在預(yù)后好組和預(yù)后差組的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明ERCC1、survivin、bax、VEGF是一組可以判斷早期NSCLC術(shù)后化療效果的指標(biāo)。本研究將符合ERCC1和survivin低表達(dá)、bax和VEGF高表達(dá)的15例與ERCC1和survivin高表達(dá)、bax和VEGF低表達(dá)的10例作生存分析，發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明ERCC1和survivin低表達(dá)、bax和VEGF高表達(dá)的早期NSCLC患者術(shù)后化療的效果好，而ERCC1和survivin高表達(dá)、bax和VEGF低表達(dá)的早期NSCLC患者術(shù)后化療的效果較差，與潘泓等［2］對(duì)早期NSCLC的研究相一致。

總之，ERCC1和survivin高表達(dá)、bax和VEGF低表達(dá)的NSCLC患者，術(shù)后生存期較短，對(duì)化療可能不敏感，術(shù)后化療意義不大，應(yīng)采取以靶向治療和生物治療為主的治療方法；而對(duì)ERCC1和survivin低表達(dá)、bax和VEGF高表達(dá)的NSCLC患者，行術(shù)后輔助化療可取得更好的效果。因此，ERCC1、survivin、bax、VEGF聯(lián)合檢測(cè)可成為判斷早中期肺癌化療療效及生存期的檢測(cè)手段，有助于確定治療方案，以提高術(shù)后生存率。

［1］ CHEN W, ZHANG S, ZOU X, et al.Evaluation on the incidence, mortality and tendency of lung cancer in China［J］.Thoracic Cancer, 2010, 1(1): 35-40.

［2］ 潘泓, 李力, 左傳田, 等.多基因蛋白表達(dá)判斷早期非小細(xì)胞肺癌術(shù)后化療療效的價(jià)值 ［J］.中華腫瘤雜志, 2008,30: 528-531.

［3］ 張楠, 魏素菊.肺癌多藥耐藥及生物逆轉(zhuǎn)［J］.實(shí)用腫瘤學(xué)雜志, 2007, 2l: 486-489.

［4］ SIMON G R,SHARMA S,CANTOR A, et a1.ERCCl expression is a predictor of survival in resected patients with non-small cell lung cancer ［J］.Chest, 2005, 127(3): 978-983.

［5］ CROTEAU D, PENG Y, VAN B H, et al.DNA repair GETS physical mapping an XPA-binding site on ERCC1［J］.DNA Repair, 2008, 7(5): 819-826.

［6］ AZUMA K, KOMOHARA Y, SASADA T, et al.Excision repair cross complementation group 1 predicts progressionfree and overall survival in non-small cell lung cancer patients treated with platinum-based chemo therapy ［J］ .Cancer Sci, 2007, 98(9): 1336-1343.

［7］ SHANKAR S I, MANI S, O'Guin K,N, et al.Survivin inhibition induces human neural tumor cell death through caspase independent and dependent pathways ［J］.J Neurochem,2001, 92(2): 426-429.

［8］ RYAN B M, O'DONOVAN N, DUFFY M J.Survivin: a new target for anti-cancer therapy ［J］.Cancer Treat Rev, 2009,35(7): 553-562.

［9］ BERRIEMAN H K, SMITH L, O'KANE S L, et al.The expression of Bcl-2 family proteins differs between non-small cell lung carcinoma subtypes ［J］.Cancer, 2005, 103(7):1415-1419.

［10］ BREKKEN R A, THORPE P E.Vascular endothelial growth factor and vascular targeting of solid tumors ［J］.Anticancer Res, 2001, 21(6B): 4221-4229.