孫 宇 盧辛辛 梁鑫淼 崔曉楠*

(1 大連醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連 116002；2 中科院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 116023）

肝癌的藥物治療處于滯后狀態(tài)，目前化療藥物對(duì)肝癌的有效率均＜20%[1]，靶向藥物對(duì)于肝癌的治療還處于研究階段。尋找、研究有效的抗肝癌藥物一直是肝癌治療的熱點(diǎn)問(wèn)題。華蟾素注射液（Cinobutacini injection，CINO） 為祖國(guó)醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)抗腫瘤藥物蟾蜍的水溶制劑，其有效成分總稱為蟾蜍毒素類（Bufotoxins）, 包括蟾蜍甾二烯類、強(qiáng)心甾烯蟾毒類、吲哚堿類、醇類及多糖、氨基酸、肽類、腎上腺素等[2]，對(duì)多種腫瘤有抑制增殖的作用，尤其對(duì)肝癌的有效率可達(dá)44.4%[3]，是一個(gè)很有發(fā)展前景的抗肝癌藥物。但是，其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步明確。本實(shí)驗(yàn)探討華蟾素注射液對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖及周期有何影響，并初步分析可能存在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)

細(xì)胞株為人肝癌HepG2（購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所）；低糖IMEM培養(yǎng)基、10%新生牛血清購(gòu)于GIBICO公司；將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中孵育（培養(yǎng)箱設(shè)為37℃、5%CO2、飽和濕度），每48h傳代1次。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

華蟾素注射液（5mL/支，濃度以主要成分吲哚生物堿為標(biāo)量測(cè)定，購(gòu)于安徽省金蟾生化股份有限公司），實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)用培養(yǎng)基將其配制成不同濃度的藥液。MTT為biosharp公司產(chǎn)品；碘化丙啶和RNA酶A購(gòu)于Sigma公司；CDK2/CyclinA激酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。RT-PCR試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況

將細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板上，5000個(gè)細(xì)胞/孔，每組設(shè)立8個(gè)平行孔。培養(yǎng)24h后將培養(yǎng)基更為含不同濃度華蟾素注射液的培養(yǎng)液（0.006μg/mL、0.013μg/mL、0.026μg/mL、0.053μg/mL、0.105μg/mL、0.21μg/mL、0.42μg/mL），200μL/孔，設(shè)立空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（未加華蟾素注射液）。分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入20μL的MTT液（濃度為5mg/mL），再避光培養(yǎng)4h后除去培養(yǎng)液，加入二亞基亞砜（DMSO）150μL/孔，震蕩后使結(jié)晶完全溶解，置于酶標(biāo)儀下將波長(zhǎng)設(shè)為570nm，應(yīng)用空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔吸光值（B）。應(yīng)用公式計(jì)算華蟾素注射液在不同濃度下對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率（IR）：IR（%）=（B對(duì)照-B試驗(yàn)）/（B對(duì)照-B空白）×100%；半數(shù)抑制濃度（IC50）的計(jì)算：取細(xì)胞存活率和劑量對(duì)數(shù)作圖求出IC50值。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)4次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布

取細(xì)胞并將細(xì)胞配成2×106個(gè)/m2的濃度，分別取2mL接種到3個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)24h后，應(yīng)用PBS沖洗1次，進(jìn)行同步化（即將培養(yǎng)基更為無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)20h），再更為含有華蟾素注射液的正常培養(yǎng)基（其終濃度為0.21μg/mL），分別培養(yǎng)48h、24h、12h后，應(yīng)用0.25%的胰蛋白酶消化下細(xì)胞，離心（1000r/min，10min）后棄去上清，應(yīng)用冷PBS沖洗2次，再加入70%的冷乙醇，置于4℃下固定12h。用PBS沖洗2次，離心后棄去上清液，加入25μL濃度為2mg/mL的RNaseA，置于37℃下作用30min，再加入1mg/mL的PI染料25μL，于4℃下避光靜置30min后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀（發(fā)射波長(zhǎng)630nm，激發(fā)波長(zhǎng)488nm）檢測(cè)凋亡細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞周期分布情況。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)4次。

表1 RT-PCR法檢測(cè)CDK2mRNA、CyclinA mRNA表達(dá)水平

1.5 RT-PCR法檢測(cè)CDK2mRNA、CyclinA mRNA表達(dá)水平

取細(xì)胞，接種于24孔板中，每孔 5×105個(gè)細(xì)胞，設(shè)華蟾素注射液濃度為0.42μg/mL、0.21μg/mL、0.105μg/mL為實(shí)驗(yàn)組，設(shè)培養(yǎng)基組為陰性對(duì)照組，培養(yǎng)48h后收集各組細(xì)胞。提取各組總RNA時(shí)應(yīng)用Trizol試劑盒（購(gòu)于Invitrogen公司）并按其說(shuō)明進(jìn)行。RT-PCR的操作按照說(shuō)明書進(jìn)行（TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0），以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件見(jiàn)表1。

將擴(kuò)增產(chǎn)物加入到濃度為1.5%瓊脂糖凝膠上，置于1×TBE緩沖液中，在電壓為90v作用下電泳30min，于紫外透視儀下觀察顯示電泳帶并用一次性成像儀掃描成像，然后進(jìn)行灰度（ID）分析。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)4次。1.6 CDK2/CyclinA激酶活性比色法定量檢測(cè)

取細(xì)胞，將細(xì)胞配成1×105個(gè)/mL的濃度，取2mL接種于直徑為60mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，孵育24h后，分別加入華蟾素注射液（0.42μg/mL、0.21μg/mL、0.105μg/mL），并設(shè)立陰性對(duì)照組（未加藥物），培養(yǎng)48h，后續(xù)操作按該試劑盒內(nèi)的說(shuō)明書進(jìn)行，并在酶標(biāo)儀下（波長(zhǎng)設(shè)為340nm）進(jìn)行檢測(cè)。

樣品的活性=[（樣品讀數(shù)-背景讀數(shù)）×樣品稀釋倍數(shù)×0.1（體系容積，mL）]/[0.005（樣品容積，mL）×6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）×0.6cm×5min]=U/mL

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

不同濃度的華蟾素注射液干預(yù)HepG-2細(xì)胞24h、48h、72h 后，IC50分別為0.48μg/ mL、0.157μg/ mL、0.08μg/ mL，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加，其對(duì)細(xì)胞的抑制率逐漸增加，并與時(shí)間和濃度呈正相關(guān)。見(jiàn)圖1。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布

濃度為0.105μg/mL的華蟾素注射液，作用HepG2細(xì)胞12h、24h、48h后，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，結(jié)果示： S期HepG2細(xì)胞所占比例與藥物作用時(shí)間呈正比，具有時(shí)間依賴性，與對(duì)照組相比差異具有顯著性（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 RT-PCR法檢測(cè)CyclinA mRNA、CDK2mRNA表達(dá)水平

應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)華蟾素注射液（0.105μg/mL、0.21μg/mL、0.42μg/mL）作用于HepG2細(xì)胞48h后，其CyclinA及CDK2 mRNA表達(dá)水平有何變化。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，隨著藥物濃度的增加CyclinA mRNA、CDK2 mRNA表達(dá)水平減低，應(yīng)用華蟾素注射液0.105μg/mL、0.21μg/mL、0.42μg/mL作用于HepG2細(xì)胞后，CyclinA mRNA與β-actin mRNA條帶灰度比值分別為（0.455±0.021）、（0.272±0.035）、（0.132±0.02），對(duì)照組灰度比值為（0.550±0.04），條帶3、4（即華蟾素注射液濃度為0.21μg/mL、0.42μg/mL）與對(duì)照組相比具有差異具有顯著性（P＜0.05），見(jiàn)圖3-1；CDK2 mRNA、β-actin mRNA條帶灰度比值分別為（0.266±0.021）、（0.167±0.015）、（0.117±0.020），對(duì)照組為（0.445±0.016），實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異具有顯著性（P＜0.05），見(jiàn)圖3-2。

2.4 CDK2/CyclinA激酶活性比色法定量檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用比色法定量法檢測(cè)華蟾素注射液作用于HepG2細(xì)胞48h后，CDK2/CyclinA激酶的活性與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)，對(duì)照組與各濃度組間差異具有顯著性 （P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

3 討 論

腫瘤為細(xì)胞周期疾病，通過(guò)阻斷細(xì)胞周期，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)抑制是目前抗腫瘤藥物的重要機(jī)制。

我們的研究表明華蟾素注射液能抑制HepG-2細(xì)胞增殖，并將細(xì)胞阻滯于S期。為探討S期阻滯機(jī)制，我們觀察了華蟾素注射液對(duì)細(xì)胞周期素A（cyclinA）及細(xì)胞周期素依賴性激酶2（cyclins dependent kinases 2，CDK2）的影響。cyclinA是人類cyclins家族中重要成員之一，在細(xì)胞周期中起正相調(diào)節(jié)作用，它首次被檢測(cè)到是在原發(fā)性肝癌細(xì)胞中，在與HBV DNA的整合部位上，這種整合被認(rèn)為是導(dǎo)致肝癌的主要原因。cyclinA存在于細(xì)胞核內(nèi)，在DNA合成過(guò)程中的G1晚期出現(xiàn)，其作為調(diào)節(jié)亞基與相應(yīng)的細(xì)胞周期素依賴性激酶（cyclins dependent kinases，CDK）中的CDK2、CDC2（cell division cycle 2）特異性結(jié)合，參與細(xì)胞DNA的復(fù)制及合成，并促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行分裂。CyclinA/ CDK2/CDC2復(fù)合物可使細(xì)胞順利完成并通過(guò)S期、G2/M期，如果該復(fù)合物表達(dá)出現(xiàn)異常，則可使具有缺陷的DNA喪失修復(fù)的時(shí)間而直接進(jìn)入細(xì)胞周期，致使其出現(xiàn)異常增殖即生成腫瘤[4-7]；而且也是腫瘤細(xì)胞惡性增殖及預(yù)后不良的指標(biāo)之一[8,9]。Dobashi Y等在對(duì)非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)CyclinA 、CDK2表達(dá)與S期細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)與患者的生存期呈負(fù)相關(guān)[10]。本研究表明華蟾素注射液能下調(diào)CyclinA、CDK2mRNA水平表達(dá)，抑制CyclinA、CDK2活性。

我們的研究提示，華蟾素注射液可能通過(guò)影響CyclinA、CDK2實(shí)現(xiàn)對(duì)HepG-2細(xì)胞S期阻滯。

[1]孫燕,石遠(yuǎn)凱.原發(fā)性肝癌,臨床腫瘤內(nèi)科手冊(cè)[M].5版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2007： 539-549.

[2]王鋒,張薇,董紅兵,等.蟾蜍的藥理研究及臨床應(yīng)用概況[J].國(guó)醫(yī)論壇,2003,18(5)：50-52.

[3]左小東,崔永安,秦叔逵,等.華蟾素抗腫瘤作用的臨床研究進(jìn)展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2003,8(3)：232-235.

[4]Fisher RP.Cdks and cyclins in transition[J].Curr Opin Gene Dev,1997,7(1)：32.

[5]King KL,Cidlowski JA.Cell cycle regulation and apoptosis[J].Annu Rev Physiol,1998,60(6)：601.

[6]Meikrantz W,Gisselbrecht S,Sun W,et al.Activation of cyclinA-dependent protein kinases during apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(9)：3754.

[7]Hoang AT,CohenK,Barrett JF,et al.Participation of cyclinA in Mycinduced apoptosis[J].Proc Nat Acad Sci USA,1994,91(15)：6875.

[8]Wang J,Chenivesse X,Henglein B,et al.Hepatis B vieus in tegration in a cyclin A gene in a hepatocellular carcinoma [J].Nature,1990,343(6258)：555-557.

[9]Nozoe T,Korenaga D,Futatsugi M,et al.Cyclin A expression in superficial squamous cell carcinoma of the esophagus and coexisting infiltrate lymphocyte follicle[J].Cancer Lett,2002,188 (122)： 2212-2229.

[10]Dobashi Y.Jiang SX,Shoji M,el al.Diversity in expression and prognostic significance of G1/s cyclins in human primary lung carcinomas[J].J Pathol,2003,199(2)：208-220.