張建勛，樂曉萍，楊 洋，朱運良

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室鄭州450001

(2010-11-04收稿 責(zé)任編輯 李沛寰)

微衛(wèi)星DNA又叫短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)，作為第二代遺傳標(biāo)記，在上世紀(jì)80年代末期之后廣泛應(yīng)用于疾病基因的定位克隆，其在腫瘤細(xì)胞染色體不穩(wěn)定性的研究、人類及其基因組的進(jìn)化和法醫(yī)學(xué)等方面也具有不可替代的作用［1-2］。許多腫瘤細(xì)胞在6號染色體長臂上發(fā)生雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)。6q21、6q23-24、6q24-25、6q27 等是幾個 LOH 的熱點區(qū)域［3-6］。為了進(jìn)一步精細(xì)定位這些缺失區(qū)域，需要更多的相距更近的STR基因座。作者對河南漢族人群6q24-25.1區(qū)域共11 Mb范圍內(nèi)STR基因座的多態(tài)性進(jìn)行研究，為其進(jìn)一步在法醫(yī)學(xué)和復(fù)雜疾病基因的定位等方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 120例河南漢族無關(guān)個體的血液樣本采集于2008年5月，來自鄭州市中心血站。其中男65例，女55例。

1.2 微衛(wèi)星的查找和引物的設(shè)計 從GenBank上下載6q24-25.1區(qū)域的DNA，序列從139 000 000～150 000 000，用Tandem Repeats Finder在線軟件在這段DNA序列上共查找到了14個STR基因座，平均間距為700 kb，重復(fù)單位為四核苷酸，這14個STR基因座的基本參數(shù)見表1。再用Primer3軟件設(shè)計這些STR基因座的PCR引物，使擴(kuò)增產(chǎn)物大小在300 bp以內(nèi)，引物序列見表2。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增 取血樣，采用酚-氯仿法提取DNA，－20℃保存。擴(kuò)增體系20μL，內(nèi)含DNA模板1 ng，上下游引物各 1.5 μL(5 μmol/L)，dNTP 0.4μL(10 mmol/L)，Taq聚合酶 1 U，10 ×Buffer(含 Mg2+1.5 mmol/L)2 μL，ddH2O 12.6 μL。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性2 min;94℃ 35 s，62℃ 45 s，72℃ 40 s，每一循環(huán)退火溫度降低0.5℃，共12個循環(huán);然后94 ℃ 35 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，20個循環(huán);最后72℃ 5 min，12℃保存。采用6 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，用銀染法顯示電泳條帶。然后檢測等位基因片段大小，用阿拉伯?dāng)?shù)字按從小到大的順序分別表示大小不同的等位基因。

表1 14個STR位點的基本參數(shù)

表2 14個STR基因座的引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用PowerStatsV12.xls(美國Promega公司)對14個STR基因座進(jìn)行分析，可得到如下常用參數(shù):多態(tài)信息含量(polymorphic information content，PIC)，雜合度(heterozygosity，H)，個體識別率(discrimination power，DP)，匹配概率(match probability，MP)，非父排除率(excluding probability of paternity，PE)，父權(quán)指數(shù)(paternity index，PI)。

2 結(jié)果

2.1 等位基因及其基因頻率 120個無關(guān)個體6號染色體的14 個 STR 基因座分別檢出5、6、2、3、6、6、7、4、7、4、4、5、4、4 個等位基因，各等位基因頻率見表3。

2.2 14個STR基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù) 14個STR基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù)見表4。結(jié)果顯示:D6SZ2、D6SZ6、D6SZ7、D6SZ8、D6SZ9 和 D6SZ12 這6個STR基因座的H、PIC和DP較高。

表3 14個STR基因座等位基因頻率(n=120)

表4 14個STR基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù)(n=120)

3 討論

人類腫瘤的發(fā)生是一個多步驟多基因異常積累的過程，包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活。抑癌基因失活的經(jīng)典機(jī)制是Kundosn的二次打擊學(xué)說，可以用LOH來發(fā)現(xiàn)和定位新的候選抑癌基因。6q24-25區(qū)域是多種腫瘤 LOH 的熱點區(qū)域［3，7］。該研究在人類基因組6q24-25.1區(qū)域中共查找到了14個STR基因座，通過對河南漢族120例健康無關(guān)個體群體調(diào)查，得到了河南漢族人群這14個基因座的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。其中 D6SZ2、D6SZ6、D6SZ7、D6SZ8、D6SZ9和D6SZ12這6個STR基因座的PIC為0.57 ～0.65(＞0.50)，DP 為 0.803 ～0.857(＞0.80)，說明這6個STR基因座是一組良好的遺傳標(biāo)記，適用于法醫(yī)學(xué)個體識別和親子鑒定。為將這些遺傳標(biāo)記更好的用于法醫(yī)學(xué)實踐，還需進(jìn)一步評估這些STR基因座在6號染色體是否存在連鎖不平衡，以便發(fā)現(xiàn)目的基因進(jìn)行基因診斷［8］。

作者挑選四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星。與二核苷酸及三核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星相比，四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增時不容易產(chǎn)生影子帶。微衛(wèi)星的平均距離為700 kb。再加上數(shù)據(jù)庫中已公布的此區(qū)域的微衛(wèi)星，就可以得到更為精細(xì)的微衛(wèi)星圖，從而為此區(qū)域復(fù)雜疾病基因的定位候選克隆提供更為精細(xì)的物理圖。

對缺失區(qū)域的精細(xì)分析有助于了解缺失的機(jī)制及其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。hZAC基因是一個定位于6q24.2區(qū)域的新的候選抑癌基因［7］。有一個頻繁發(fā)生的區(qū)域被限定在hZAC基因周圍的D6S292-D6S310-D6S311之間，此區(qū)域已在乳癌中被鑒定［9］。根據(jù)人類基因組圖譜可知hZAC定位于6q24區(qū)域的D6S308和D6S978之間，物理位置為144 261 437～144 385 735 bp，恰好在該報道的D6SZ7和D6SZ8之間。作者希望用新查找到的這些高密度的多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記將此區(qū)域定位于更精確的范圍，為進(jìn)一步精確分析斷裂點打下基礎(chǔ)。

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