徐曉杰，周 鳴，李桂源#

1)南陽醫(yī)學高等?？茖W校病理學教研室南陽 473000 2)中南大學湘雅醫(yī)學院腫瘤研究所分子遺傳室長沙 410078 #通訊作者，男，1951年11月生，博士，教授，研究方向:鼻咽癌的分子遺傳學，E-mail:ligy@xysm.net

bromodomain結構域對溴區(qū)包含蛋白7亞細胞定位的影響*

徐曉杰1)，周 鳴2)，李桂源2)#

1)南陽醫(yī)學高等專科學校病理學教研室南陽 473000 2)中南大學湘雅醫(yī)學院腫瘤研究所分子遺傳室長沙 410078 #通訊作者，男，1951年11月生，博士，教授，研究方向:鼻咽癌的分子遺傳學，E-mail:ligy@xysm.net

鼻咽癌;缺失突變;亞細胞定位;bromodomain;溴區(qū)包含蛋白7

目的:探討溴區(qū)包含蛋白7(BRD7)的亞細胞定位以及bromodomain結構域對BRD7亞細胞定位的影響。方法:首先采用GFP介導的亞細胞定位方法，在非洲綠猴腎COS7細胞中考察BRD7的亞細胞定位;然后分別構建bromodomain缺失型的BRD7重組體pCMV-Myc/BRD7△brd和pEGFP-C2/BRD7△brd，并通過GFP介導的亞細胞定位方法和間接免疫熒光方法，分別在COS7中考察bromodomain缺失型BRD7的亞細胞定位，從而探討B(tài)RD7的bromodomain結構域對其亞細胞定位的影響。結果:成功構建了pCMV-Myc/BRD7△brd和pEGFP-C2/BRD7△brd。BRD7及bromodomain缺失型BRD7在COS7中均主要定位在細胞核，與染色質的分布存在一定程度的相似性。結論:bromodomain結構域的缺失并不影響B(tài)RD7的細胞核分布，但是在核內的分布模式發(fā)生了一定的改變。

溴區(qū)包含蛋白7(BRD7)是中南大學湘雅醫(yī)學院腫瘤研究所分子遺傳室通過cDNA代表性差異分析、文庫篩選等方法分離克隆的一個cDNA全長新基因［1］。該基因在鼻咽癌細胞系和活檢組織中表達下調，細胞計數、軟瓊脂集落形成、流式細胞分析及裸鼠成瘤等細胞生物學實驗［2］結果均支持BRD7具有抑制鼻咽癌細胞生長的功能，提示BRD7為鼻咽癌抑瘤基因強有力的候選者。進一步的實驗［3］結果顯示，BRD7可能通過Ras/MEK/ERK和Rb/ E2F 2條通路影響細胞周期的進程，使細胞停滯于G0/G1期。同時研究［4］發(fā)現，BRD7能夠與核轉錄因子BRD2、IRF2等發(fā)生交互作用，推測BRD7為一個潛在的核轉錄調節(jié)因子。BRD7含有一個bromodomain結構域，屬于bromodomain家族成員。bromodomain是一種高度保守的結構域，一般由60～110個氨基酸殘基組成。該家族的大多數成員與基因的轉錄調控有關，并證實了一些bromodomain蛋白是核轉錄因子，參與基因的轉錄調控［5］。因此，該研究主要探討B(tài)RD7的亞細胞定位，另一方面通過構建BRD7的bromodomain缺失突變體，探討bromodomain結構域對BRD7亞細胞定位的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

1.1.1 質粒、菌株和細胞系 大腸桿菌JM109和真核表達質粒(pEGFP-C2、pCMV-Myc)由中南大學湘雅醫(yī)學院腫瘤研究所分子遺傳室購買并保存。插入了BRD7全長cDNA的真核表達重組質粒pEGFP-C2/BRD7和pCMV-Myc/BRD7由中南大學湘雅醫(yī)學院腫瘤研究所分子遺傳室構建保存。非洲綠猴腎COS7細胞購自中國醫(yī)學科學院細胞庫。

1.1.2 主要試劑和抗體 限制性內切酶(XhoⅠ、PstⅠ和EcoRⅠ等)、T4 DNA連接酶購自Promege公司，高保真酶(Pyrobest DNA聚合酶)、dNTP和T4多聚核苷酸激酶等購自大連寶生物公司;抗Myc單克隆抗體(Ab-Myc)購于Clontech公司;ECL化學發(fā)光試劑購自Pirece公司;RPMI 1640培養(yǎng)基為Gibco公司產品。

1.1.3 核苷酸引物的分析與合成、測序 利用Goldkey軟件分析設計好的引物，確認引物內無發(fā)夾結構，引物間無二聚體形成。P1(正義:5’-AAAGCTGCAAAGAAGCTGTTGCACTCA-3’;反義: 5’-CAATTGTCTCATCAGTTGATTCAAAGC-3’)為構建BRD7的bromodomain(148～218)缺失突變體pCMV-Myc/BRD7△brd的引物;P2(正義:5’-AAT CTCGAGTATGGGCAAGAAGCACAAGAAGCACAAG-3’;反義:5’-ATACTGCAGTCAACTTCCACCAGGTC CACACTC-3’)為將bromodomain缺失型BRD7片段連接到pEGFP-C2載體中(構建pEGFP-C2/BRD7△brd)的引物。所有引物合成和重組質粒測序均由上海博亞公司完成。

1.2 bromodomain缺失型BRD7重組體的構建①構建bromodomain缺失型BRD7重組質粒pCMVMyc/BRD7△brd。利用設計好的引物P1，以pCMVMyc-BRD7為模板。PCR反應體系為50 μL:模板DAN 5 μL，高保真酶1 μL，引物4 μL，10×Buffer 5 μL，dNTP 8 μL，ddH2O 27 μL。按如下條件進行PCR擴增:95℃變性5 min，94℃變性30 s，68℃退火延伸5.5 min，擴增30個循環(huán);72℃終末延伸10 min。產物回收純化后用T4 PNK進行5’端磷酸化處理。最后用T4 DNA連接酶進行自身環(huán)化連接，連接產物進行轉化。采用EcoRⅠ對挑選克隆進行初步鑒定后，送測序鑒定。②構建pEGFP-C2/BRD7△brd重組體。采用設計的引物P2，以上述構建好的pCMV-Myc/BRD7△brd質粒為模板，按如下條件進行PCR擴增:95℃變性5 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，擴增30個循環(huán);最后終末延伸10 min。PCR產物回收純化后用XhoⅠ和PstⅠ消化接頭，再與經過同樣雙酶切消化的pEGFP-C2載體連接，最后轉化，重組質粒酶切鑒定與測序。

1.3 Western Blot 在6孔板中分別接種2.0× 105個/孔的 COS7細胞。次日，待細胞長滿至50%～70%后，采用脂質體介導的細胞轉染方法，分別將pCMV-Myc、pCMV-Myc/BRD7和pCMV-Myc/ BRD7△brd 3種質粒各1.5～2.0 μg轉染到上述COS7中，瞬時表達后收獲細胞。采用三去污裂解緩沖液抽提細胞總蛋白［6］，蛋白樣品變性后經120 g/ L的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉至硝酸纖維素膜上。然后再經50 g/L的脫脂奶封閉，Ab-Myc一抗4℃孵育過夜，相應羊抗小鼠二抗37℃孵育1 h，ECL發(fā)光試劑顯色，膠片壓片后顯影、定影。

1.4 GFP介導的蛋白亞細胞定位 首先在6孔板的每個孔中分別放置一塊蓋玻片，然后接種1.5× 105個/孔的COS7細胞。按1.3方法分別將pEGFP-C2/BRD7、pEGFP-C2/BRD7△brd 2種質粒各1.5～2.0 μg轉染到上述細胞中。瞬時表達后，取出蓋玻片。丙酮/甲醇(體積比1∶1)固定細胞，DAPI染色后，再于熒光顯微鏡下觀察、攝片。

1.5 免疫熒光實驗考察蛋白的亞細胞定位 采用1.3方法分別將pCMV-Myc/BRD7和 pCMV-Myc/ BRD7△brd 2種質粒各1.5～2.0 μg轉染到COS7細胞中，瞬時表達后，取出蓋玻片。丙酮/甲醇(體積比1∶1)固定細胞，抗原修復液對細胞進行核抗原修復，體積分數0.25%Triton-100處理30 min，正常血清封閉30 min，Ab-Myc一抗4℃孵育過夜，Cy3標記的羊抗鼠二抗37℃孵育1 h。DAPI染色后，于熒光顯微鏡下觀察、攝片。

2 結果

2.1 質粒pCMV-Myc/BRD7△brd的鑒定 重組質粒EcoRⅠ酶切鑒定結果見圖1。若無 bromodomain結構域的缺失，則酶切產物片段應為5 000 bp+760 bp;若有bromodomain結構域的缺失，則酶切產物片段應為5 000 bp+547 bp。故2號克隆為候選陽性克隆，將2號克隆送測序鑒定(圖2)。測序結果表明bromodomain結構域已完整缺失，銜接處及整個BRD7編碼區(qū)無堿基缺失、錯配和移位。Western Blot檢測結果顯示外源表達的BRD7缺失型蛋白比野生型BRD7低，大小約為68 000，與預測大小完全一致(圖3)，表明bromodomain缺失型BRD7重組體pCMV-Myc/BRD7△brd構建成功。

2.2 pEGFP-C2/BRD7△brd的鑒定 重組質粒XhoⅠ和PstⅠ雙酶切鑒定結果見圖4，發(fā)現1、2號克隆均為陽性克隆，隨機挑選1號克隆送測序鑒定。測序結果表明，重組體pEGFP-C2/BRD7△brd中BRD7的bromodomain結構域完整缺失，無序列錯配和閱讀框架改變(圖5)，表明 pEGFP-C2/BRD7△brd構建成功。

圖4 XhoⅠ和PstⅠ雙酶切

圖5 pEGFP-C2/BRD7△brd重組體測序圖

2.3 bromodomain對BRD7蛋白亞細胞定位影響結果表明，bromodomain缺失并不影響B(tài)RD7的細胞核分布，但是在核內的分布模式發(fā)生了一定的改變，野生型BRD7在核內主要以細點狀或條索狀分布，相對均勻(圖6A和圖7A);bromodomain缺失型BRD7主要以顆粒狀分布，不規(guī)則(圖6B和圖7B)。

3 討論

BRD7含有一個bromodomain結構域，屬于bromodomain家族成員。bromodomain是近年來發(fā)現的廣泛分布于多種生物中的一種高度保守的結構域，一般由60～110個氨基酸殘基組成［5］。許多bromodomain蛋白家族成員的bromodomain結構域參與了組蛋白的乙?；饔?，與基因的轉錄調控相關聯。蛋白乙?；腿ヒ阴；堑鞍谆钚哉{節(jié)的一種重要形式，通過乙?；蛉ヒ阴；?，改變了染色質結構或是轉錄因子的活性，從而使下游靶基因的表達水平發(fā)生改變［6-9］。先前的研究［10］發(fā)現，BRD7能夠和乙?；慕M蛋白 H3結合，說明 bromodomain在BRD7基因功能發(fā)揮中可能起到了關鍵的作用。

轉錄因子有2種分布形式:胞核形式和潛在的胞質形式;蛋白質在這2種分布形式下的功能完全不同［11］。作者考察了BRD7在COS7細胞中的定位，發(fā)現BRD7主要定位在細胞核，呈條索狀或片狀分布。這種分布同活性染色質的分布比較一致，也可能是其轉錄活性功能發(fā)揮的關鍵所在。文獻［12］報道，多種bromodomain家族的成員都有類似的分布模式，如BRD4等。因而BRD7在細胞內的定位模式與其功能發(fā)揮是統(tǒng)一的。

缺失突變是研究蛋白質結構與功能關系常用的方法和手段，是架構蛋白質結構和功能的橋梁和紐帶。BRD7是bromodomain蛋白家族的成員，其bromodomain結構域可能在BRD7的亞細胞定位和功能發(fā)揮過程中起了關鍵的作用。為此作者通過一種新型PCR方法［13］構建了bromodomain缺失的BRD7突變體，并通過測序和表達分析的方法進行了證實。結果顯示，bromodomain缺失并不影響B(tài)RD7的細胞核分布，但是在核內的分布模式發(fā)生了一定的改變。bromodomain缺失型BRD7主要以粗點狀分布，不規(guī)則;與野生型BRD7在核內的分布模式存在一定不同。BRD4亦為bromodomain蛋白家族成員，含有2個bromodomain結構域。野生型BRD4的核定位分布與活性染色質的分布比較一致，但當bromodomain缺失突變后(無論是單個bromodomain的缺失，還是雙bromodomain同時缺失)，BRD4在核內的分布發(fā)生明顯改變，與染色質的分布完全不同［14-15］，說明bromodomain在BRD4的核內分布模式上起了關鍵作用。

上述改變是否與BRD7的細胞生物學功能直接相關，仍有待于進一步的研究。

［1］Wu M，Li X，Li X，et al.Signaling transduction network mediated by tumor suppressor/susceptibility genes in NPC［J］.Curr Genomics，2009，10(4):216

［2］Li XL，Wu MH，Li GY.Functional genomics of nasopharyngeal carcinoma susceptibility/suppressor gene［J］.Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2008，33(7):553

［3］李淑芳，周鳴，劉華英，等.BRD7調控Rb/E2F通路的分子機制研究［J］.生物化學與生物物理進展，2007，34 (8):881

［4］Gyuris A，Donovan DJ，Seymour KA，et al.The chromatintargeting protein Brd2 is required for neural tube closure and embryogenesis［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1789 (5):413

［5］LeRoy G，Rickards B，Flint SJ.The double bromodomain proteins Brd2 and Brd3 couple histone acetylation to transcription［J］.Mol Cell，2008，30(1):51

［6］程曉麗，神吉智丈，李春燕，等.熱休克蛋白10和熱休克蛋白60的表達、純化及與線粒體DNA轉錄因子A相互結合［J］.鄭州大學學報:醫(yī)學版，2007，42(1):50

［7］孫陸果，馬克威.Prohibitin 2調節(jié)肌細胞增強因子2轉錄因子活性的分子機制［J］.吉林大學學報:醫(yī)學版，2009，35(5):774

［8］周鵬，何鳳田，劉東擘，等.人類乳頭瘤病毒18 E7原癌蛋白對宮頸癌細胞系中組蛋白去乙酰化酶1表達的下調作用［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2010，32(2):139

［9］楊文婷，劉樹艷，鄭鵬生.轉錄因子KLF4在宮頸癌中的表達及意義［J］.西安交通大學學報:醫(yī)學版，2010，31 (1):22

［10］Senthilkumar R，Mishra RK.Novel motifs distinguish multiple homologues of Polycomb in vertebrates:expansion and diversification of the epigenetic toolkit［J］.BMC Genomics，2009，10:549

［11］李敏，紀澤泉，陳永達.核轉錄因子-κB反義核酸對腎小球硬化細胞炎性反應的干預［J］.實用兒科臨床雜志，2008，23(15):1190

［12］You J，Li Q，Wu C，et al.Regulation of aurora B expression by the bromodomain protein Brd4［J］.Mol Cell Biol，2009，29(18):5094

［13］殷德濤，王琳，尹峰燕，等.分化型甲狀腺癌組織中脆性組氨酸三聯體基因外顯子5、8純合性缺失及突變檢測［J］.鄭州大學學報:醫(yī)學版，2008，43(2):242

［14］Lee AY，Chiang CM.Chromatin adaptor Brd4 modulates E2 transcription activity and protein stability［J］.J Biol Chem，2009，284(5):2778

［15］Lin YJ，Umehara T，Inoue M，et al.Solution structure of the extraterminal domain of the bromodomain-containing protein BRD4［J］.Protein Sci，2008，17(12):2174

Effects of bromodomain on subcellular localization of BRD7

XU Xiaojie1)，ZHOU Ming2)，LI Guiyuan2)1)Department of Pathology，Nanyang Medical School，Nanyang 473000 2)Department of Molecular Genetics，Cancer Research Institute，Xiangya School of Medicine，Central South University，Changsha 410078

nasopharyngeal carcinoma;deletion mutation;subcellular localization;bromodomain;BRD7

Aim:To investigate the subcellular localization of BRD7 and the effects of bromodomain on its localization.Methods:Firstly，the subcelluar localization of BRD7 was detected in COS7 cells by direct GFP fluorescence.Secondly，bromodomain deleted BRD7 mutations，pCMV-Myc/BRD7△brd and pEGFP-C2/BRD7△brd，were constructed to investigate the effects of bromodomain on the subcellular localization of BRD7 in COS7 cells by GFP fluorescence and indirect immunofluorescence.Results:It was found that BRD7 and bromodomain deleted BRD7 mutations were all mainly localized in nucleus，which was similar to the nuclear distribution of chromatin，to some extent.Conclusion:Bromodomain deletion may not affect the nuclear localization of BRD7，but the localization pattern of BRD7 in nucleus is changed.

R739.6

*國家自然科學基金資助項目 30300175，30200135，30400238，30470367

(2010-11-25收稿 責任編輯姜春霞)