筆雪艷，劉曉鳳，張清波，仲昭慶

(1.黑龍江省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所，黑龍江 哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

桔梗(Platycodonis Radix)為桔梗科植物桔梗［Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.］的干燥根，氣微，味微甜而后苦。具有宣肺，利咽，祛痰，排膿之功效，用于咳嗽痰多，胸悶不暢，咽痛音啞，肺癰吐膿［1］?！吨袊?guó)藥典》2005年版一部桔梗項(xiàng)下有鑒別和含量測(cè)定項(xiàng)目，但其含量測(cè)定以重量法測(cè)定其中的總皂苷，方法專屬性不強(qiáng)，重現(xiàn)性不好。為了更好的控制桔梗藥材及飲片的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)全國(guó)收集的8批桔梗藥材及5批桔梗飲片進(jìn)行了水分、總灰分和浸出物的測(cè)定，并采用高效液相色譜法對(duì)桔梗藥材及飲片進(jìn)行了定量研究，制定了全面控制桔梗藥材及飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(SEDEX 75)及DAD檢測(cè)器;XWK－3A空氣泵(天津市華生儀器分析廠);BP211D電子天平(德國(guó)Sartorius公司);乙腈為色譜純;水為超濾水;其它試劑、試藥均為分析純;桔梗對(duì)照藥材(批號(hào)121028－200507，中國(guó)藥品生物制品檢定所);對(duì)照品桔梗皂苷D(自制，純度為98.6%);8批桔梗藥材(來(lái)源見表1，經(jīng)筆者鑒定均為桔?？浦参锝酃＃跴latycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.］的干燥根);5批桔梗飲片(見表2，分別為浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠(3批)及哈藥集團(tuán)世一堂中藥飲片公司(2批)加工)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別 取本品粉末1g，加7%硫酸乙醇－水(1∶3)混合液20ml，加熱回流3h，放冷，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，加水洗滌2次，每次30ml，棄去洗液，三氯甲烷液用無(wú)水硫酸鈉脫水，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取桔梗對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法，吸取上述兩種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙醚(2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，見圖1。

圖1 桔梗薄層色譜圖

2.2 水分、總灰分及浸出物的測(cè)定

2.2.1 測(cè)定方法 水分測(cè)定參照《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄IX H水分測(cè)定法第一法;總灰分測(cè)定參照《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄IX K灰分測(cè)定法;浸出物測(cè)定參照《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄X A浸出物測(cè)定法，用乙醇作溶劑照醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定。

2.2.2 測(cè)定結(jié)果 8批桔梗藥材及5批桔梗飲片的水分、總灰分及浸出物的測(cè)定結(jié)果見表1、表2。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，YMC－Pack ODS－A(250mm×4.6mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈 － 水(25∶75)［2］;檢測(cè)器:蒸發(fā)光散射檢測(cè)器;漂移管溫度108℃，載氣流速3.0 L/min，流速1.0ml/min。理論板數(shù)按桔梗皂苷D峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取桔梗皂苷D對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含桔梗皂苷D 0.5mg的溶液，即得。

表1 桔梗藥材中水分、總灰分、浸出物及桔梗皂苷D測(cè)定結(jié)果

表2 桔梗飲片中水分、總灰分、浸出物及桔梗皂苷D測(cè)定結(jié)果

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約2.0g，精密稱定，精密加入甲醇50ml，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25ml，置水浴上蒸干，殘?jiān)铀?0ml，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用氨試液50ml洗滌，棄去氨試液，再用正丁醇飽和的水50ml洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)眉状?ml使溶解，加硅膠0.5g拌勻，置水浴上蒸干，加于以氯仿－甲醇(9∶1)裝好的硅膠柱(內(nèi)徑2cm，10g)上，以氯仿 － 甲醇(9∶1)50ml洗脫，棄去洗脫液，再以氯仿－甲醇－水(60∶20∶3)100ml洗脫，棄去洗脫液，繼用氯仿 － 甲醇－水(60∶29∶6)100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5ml量瓶中，搖勻，即得。

2.3.4 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液5μl、10μl，供試品溶液10～15μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，即得。色譜圖見圖2。

圖2 桔梗樣品的HPLC圖 1桔梗皂苷D

2.3.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液(0.501 2mg/ml)5μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，桔梗皂苷D峰面積積分值的RSD為2.5%。

2.3.6 線性范圍

分別精密吸取對(duì)照品溶液(0.501 2 mg/ml)2、5、10、15、20μl，注入液相色譜儀，以峰面積的常用對(duì)數(shù)值Y為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量的常用對(duì)數(shù)值X為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1.738 2X+2.220 9，γ=0.999 6。結(jié)果表明，桔梗皂苷D在1.002 4～10.024 μg之間，其濃度的對(duì)數(shù)值與峰面積的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批桔梗藥材樣品(編號(hào)4)按供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，測(cè)得桔梗中桔梗皂苷D的含量為0.12%，6次測(cè)定的 RSD為1.3%。結(jié)果表明:本方法的重復(fù)性良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批桔梗藥材供試品溶液(編號(hào)4)，分別于0，4，8，40h測(cè)定，桔梗中桔梗皂苷 D含量的 RSD為0.9%，表明該供試品溶液在40h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.9 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批桔梗藥材樣品(編號(hào)4)約1.0g共6份，精密加入上述對(duì)照品溶液2.0ml，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法操作，按上述色譜條件測(cè)定，平均加樣回收率101.3%，RSD為4.4%。結(jié)果表明，本法的回收率良好。

2.3.10 樣品含量測(cè)定 取8批桔梗藥材及5批桔梗飲片依法測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表1～2。

3 討論

實(shí)驗(yàn)所收集的藥材為野生與栽培品種并存，具有一定的代表性;飲片的加工均為獲得GMP認(rèn)證的飲片加工企業(yè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桔梗藥材及桔梗飲片浸出物及桔梗皂苷D含量各批次間最大值與最小值的差異不足2倍，且桔梗藥材經(jīng)過(guò)炮制制成桔梗飲片后，浸出物及桔梗皂苷D的變化亦不大。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，桔梗藥材的標(biāo)準(zhǔn)暫定為:水分不得過(guò)15.0%;總灰分不得過(guò)6.0%;浸出物不得少于17.0%;桔梗皂苷D不得少于0.10%。桔梗飲片的標(biāo)準(zhǔn)暫定為:水分不得過(guò)12.0%;總灰分不得過(guò)5.0%;浸出物及含量測(cè)定同藥材。上述指標(biāo)均為在2005年版《中國(guó)藥典》基礎(chǔ)上新增的控制指標(biāo)。同時(shí)，為了在薄層色譜上取得最佳的色譜條件，將薄層色譜鑒別進(jìn)行修訂［3］，有利于更好地控制其藥材及飲片的質(zhì)量。

桔梗皂苷為桔梗的有效部位，以桔梗皂苷D為代表的三萜皂苷類成分為桔梗的主要及有效成分，并具有鎮(zhèn)咳、祛痰、解熱鎮(zhèn)痛等與桔梗功能主治有關(guān)的藥理作用［4］。以桔梗皂苷D為對(duì)照品對(duì)桔梗藥材及飲片的質(zhì)量進(jìn)行控制，具有更強(qiáng)的專屬性，含量測(cè)定方法的穩(wěn)定、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。可用于桔梗藥材及飲片的質(zhì)量控制。

由于桔梗皂苷D只有一個(gè)C=C雙鍵，無(wú)共軛結(jié)構(gòu)，無(wú)強(qiáng)的發(fā)色基團(tuán)，紫外吸收弱，且末端吸收在210nm有較大的干擾，使得檢測(cè)靈敏度降低，因此選用蒸發(fā)光散射檢測(cè)法檢測(cè)。在供試品溶液制備的過(guò)程中，如果不使用硅膠柱，有時(shí)也可得到單一的色譜峰，但DAD檢測(cè)器顯示，在與桔梗皂苷D相同保留時(shí)間處色譜峰不純。且通過(guò)改變流動(dòng)相的組成及比例均達(dá)不到良好的分離效果，因此，將供試品采用正相硅膠柱分離后，在高效液相色譜儀上分離較好。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:259 －260.

［2］ 李偉，張晶，李慧萍，等.桔梗皂苷D對(duì)照品的制備［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18(1):55－56.

［3］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典中藥材薄層色譜彩色圖集［S］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:633 －635.

［4］ 肖培根.中藥志［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2002:766－771.